Epigenetika - RNA interference

1. Epigenetika- RNA interference

2. Objev RNA interference (1998) - umlčování exprese genů dvojvláknovou RNA Cenorhabditis elegans

3. Antisense RNA (= RNA komplementární k mRNA) umlčuje expresi (již počátek 80. let 20. století) určitý gen je možné umlčet vnesením antisense RNA (nebo přepisem genu v opačné orientaci) • na základě komplementarity dochází • ke spojení mRNA a antisense RNA, • k tvorbě dsRNA

4. Jak antisense RNA umlčuje expresi? Původní (!) hypotézy: - antisense RNA mechanicky brání translaci - dsRNA (vč. mRNA) je degradována (RNázami)

5. Kosuprese u Petůnie Cíl: zvýšení exprese genu pro enzym syntézy pigmentu Výsledek: ztráta pigmentace v částech květu Napoli et al. 1990 Plant Cell 2:279–289

6. Kosuprese u Petůnie Exprese antisense RNA méně účinná Napoli et al. 1990 Plant Cell 2:279–289 Mechanismus kosuprese?

7. Za co tedy dostali Nobelovku? - dělat kontroly se vyplatí! vnesení i velmi malého množství dsRNA vede ke specifickému umlčení exprese (antisence RNA není tak účinná!) dsRNA tedy musí být signálem k umlčování! Andrew J. Hamilton,David C. Baulcombe*(1999): A Species of Small Antisense RNA in Posttran- scriptional Gene Silencing in Plants

8. RNA interference (RNAi) = umlčování exprese genů prostřednictvím malých RNA (small RNA, sRNA 21-24(25)nt) The precise role of 25-nt RNA in PTGS remains to be determined. However, because they are long enough to convey sequence specificity yet small enough to move through plasmodesmata, it is possible that they are components of the systemic signal and specificity determinants of PTGS.

9. RNA interference (RNAi)umlčování exprese genů na • transkripční úrovni (TGS) • (transcriptional gene silencing) • - indukce metylace DNA (nevzniká mRNA) • na posttranskripční úrovni (PTGS) • (posttranscriptional gene silencing) • - rozštěpení transkriptu • - blokování translace

10. Základní mechanismus RNAi (jakákoli) dsRNA v buňce je štěpena enzymem DICER-like na krátké dsRNA fragmenty – malé RNA (21-24 nt) Jedno z vláken malé RNA spolu s proteinem Argonaute zprostředkovává rozpoznání komplementárních sekvencích určených k umlčení (TGS, PTGS)

11. Malé RNA • - u rostlin je 3’ konec sRNA metylovaný (HEN1) • miRNA (micro) – z transkriptů RNA Pol II (pre-miRNA) – stovky MIR genů (in trans) • siRNA (small interfering) – z dsRNA různého externího i interního původu - tisíce typů (in cis i in trans) pre-miRNA Wang et al. 2004

12. Dicer-like • - štěpení dsRNA (21-24nt) • v Arabidopsis 4 paralogy • (různé funkce) • DCL1 – pre-miRNA (21 nt miRNA) • DCL3 – tvorba 24 nt siRNA pro TGS • (RdDM) • DCL2, 4 – hlavně protivirová obrana • (21-22 ntsiRNA)

13. ArgonauteRNA binding protein(20-26 nt RNA)- výběr vlákna (5’ nt, účast HSP90) - u Arabidopsis 10 genů - součást RISC (RNA induced silencing complex)- blokování translace nebo slicer (RNAse H-like endonuclease – PIWI doména)- účast při TGS (RdDM)(RNA directed DNA methylation)

14. Mechanismus účinku malých RNA Pol V • PTGS: - specifická degradace transkriptu • blokování translace • TGS: - metylace promotoru, heterochromatinizace (kompaktní uspořádání), znemožnění vazby transkripčních faktorů

15. Mechanismus účinku malých RNA závisí mj. na míře komplementarity - nekomplementarita v místě štěpení brání RNázové aktivitě

16. RdRP = RNA dependentní RNA Polymeráza - syntéza komplement. vlákna • templát – transkripty přestřižené RISC • - poškozené mRNA (bez polyA či čepičky) • - transkripty RNA polymerázy IV Jak vzniká dsRNA? Sekundární struktury virových RNA (MIR gen) ? Štěpení Ago (sekundární siRNA )

17. RNA polymerázy v RNAi RNA dependentní RNA polymerázy (RdRP, RDR) - nutné pro tvorbu většiny siRNA RDR6: - tvorba dsRNA na „divných“ RNA (bez polyA, bez čepičky) = primární siRNA - tvorba dsRNA z produktů štěpení Ago = sekundární malé RNA (ovlivněno komplementaritou mezi vlákny v rámci primární miRNA) - blízký homolog RDR1 - v protivirové obraně RDR2: tvorba dsRNA na produktech RNA polymerázy IV

18. RNA polymerázy v RNAi DNA dependentní RNA polymerázy (Pol IV a Pol V) - příbuzné RNA polymeráze II (sdílejí řadu podjednotek) - rostlinně specifické RNA polymeráza IV - transkripce oblastí s H3K9me2 a nemetyl. H3K4 (SHH1) - krátké transkripty (stovky nt), s čepičkou, bez polyA - přepisovány RDR2  dsRNA  DCL3  siRNA RNA polymeráza V - transkripce nutná pro metylaci DNA řízenou malými RNA (RdDM) - přímá vazba AGO4 pro rozpoznání cílové sekvence RNA polymeráza II – mechanismus nejasný

19. RNA directed DNA metylation SHH1 Pol IV a V – RNA polymerázy RDR2 - RNA dep.RNA polymeráza DCL3 – dicer-like protein AGO4 – ARGONAUTE DRM2 – de novometyltransferase DRD1 – chromatin remodelling protein SHH1 – dual histon-codereading (H3K9me2, H3K4) SHH1 Saze etal. 2012 Zhang et al. 2013 - metylace (DRM2) podmíněna interakcí AGO4(6)-siRNA s RNA Pol V (C-term doména velké podjednotky)

20. RNA directed DNA metylation • de novo metylace transpozónů v nových místech inzerce • metylace v případech, kde přenos informace (CMT2/3) z metylace histonu nemusí být spolehlivý (málo nukleozómů)? SHH1 SHH1 Zhang et al. 2013 Zemach et al. 2013

21. RdDM – role Polymerázy II • u některých sekvencí nutná k metylaci • - napomáhá funkci Pol V (nebo jí nahrazuje)? • - navádí Pol IV? • - tvoří nekódující transkripty pro amplifikaci siRNA

22. Tvorba sekundárních siRNA • - cílová RNA (mRNA, TAS transkript) štěpena za účasti primární sRNA (miRNA či siRNA) • - RDR6 – syntéza komplementárního vlákna k rozštěpené RNA: • dsRNA  DCL2(4)  sekundární siRNA • sekundární siRNA • amplifikace signálu • tvorba siRNA z jiných sekvencí • (transitivita) • jiné cílové molekuly – př. ta-siRNA • (miRNA na TAS) • (trans-acting siRNA – rozšíření záběru miRNA)

23. dsRNA Kosuprese u Petůnie - zvýšení exprese genu pro enzym syntézy pigmentu nečekaně způsobilo ztrátu pigmentace v částech květu K aberantním („podezřelým“) transkriptům vytváří RdRP (RDR6; = RNA dependentní RNA polymeráza) komplementární vlákno - ze vzniklé dsRNA se tvoří malé RNA, které blokují expresi příslušného genu (transgenu in cis a interního rostlinného genu in trans) Praktické využití při funkčních analýzách genů (modulaci exprese) – overexprese i knock-out jedním konstruktem!

24. Paramutace interakce (in trans) mezi homologními alelami (epialelami), která vede k dědičné změně v genové expresi jedné z alel (epimutaci) • paramutagenní a paramutovatelná alela • Mechanismus?

25. Paramutace interakce (in trans) mezi homologními alelami (epialelami), která vede k dědičné změně v genové expresi paramutovatelné alely paramutagenní alela paramutovatelná alela • metylovaná, transkripčně neaktivní alela je přepisována Pol IV • - z jejích transkriptů vznikají siRNA, které mohou měnit epigenetický stav (metylaci) u homologních sekvencí MOP1 = homolog RDR2 MOP2 = podj. Pol IV a V (mediator of paramutation)

26. Dráhy RNAi u rostlin - přehled a b c d + Inverted repeat Natural antisense (DNA methylation) Molnáretal. 2011 + sekundární siRNA (z jakéhokoli transkriptu štěpeného primární sRNA)

27. Tvorba siRNA z dsRNA není rovnoměrná - liší se místem, velikostí, výběrem vlákna, … - závisí na primárním spouštěči - převaha sense-spec. siRNA Roub s primární tvorbou siRNA Podnož (netransformovaná) sekundární siRNA (vzniklé transitivitou): štěpení mRNA - AGO1-siRNA, RDR6, DCL(4)

28. Systémová rezistence • nově se tvořící listy jsou odolné • vůči virové infekci (1928) Mechanismus?

29. Šíření umlčujícího signálu - plasmodesmy - floémem (= pasivně ve směru toku)

30. Šíření umlčujícího signálu - celková představa: siRNA (ale asi i miRNA), 24 nt (ale asi i 21 nt) duplex sRNA (ss u miRNA?)

31. Vizualizace šíření umlčování - umlčování GFP mobilním signálem (od cévních svazků) umlčování exprese GFP - zelená fl., červená = autofluorescence chlorofylu

32. Funkce RNAi a šíření sRNA na dlouhé vzdálenosti - protivirová obrana -bránění nové infekci či šíření infekce - obrana proti transpozónům – udržování heterochromatinu - regulace vývojových procesů - prakticky všech - v odpovědi na stres - regulace získávání živin - regulace příjmu (např. fosfor) - epigenetická modulace genetické informace v meristému (dědičné změny) - v environmentálních dědičných (!) adaptacích (Lamarckismus)

33. Epigenetická regulace genové exprese ve vývoji rostlin • regulace především prostřednictvím miRNA (21 nt) • (kódované jako pri-miRNA - štěpeny DCL1) • - u Arabidopsis stovky MIR genů • někdy zprostředkováno ta-siRNA - nekódující TAS transkript • (štěpený v důsledku nasednutí RISC s miRNA, RDR6, …) • - často šíření mezi sousedícími buňkami (non-cell autonomous) • cílem jsou zpravidla geny pro regulační proteiny • např. transkripční faktory, komponenty ubiquitinační dráhy, … • (omezená spolehlivost výsledků z promotorových fúzí!)

34. př. úloha miRNA a ta-siRNA ve vývoji listu Arabidopsis Pulido A , Laufs P J. Exp. Bot. 2010;61:1277-1291

35. př. ustavení polarity listu – gradient ta-siRNA Arabidopsis: - gradient dán místem exprese TAS3 a AGO7 Kukuřice: - gradient dán místem exprese miR390 Pulido A , Laufs P J. Exp. Bot. 2010;61:1277-1291

36. Epigenetická regulace genové exprese ve vývoji rostlin Fenotypové změny navozené expresí miRNA-resistentních variant cílových genů (stejný protein, jiná nukleotidová sekvence) Fenotypové změny navozené potlačením exprese určité miRNA

37. Parentální imprinting • odlišná epigenetická modifikace (rodičovský vtisk) alel děděných od jednotlivých rodičů (vede k jejich odlišné expresi po splynutí gamet) • = alela určitého genu je u jedné z gamet metylována • paralelně vytvořeno u savců a krytosemenných rostlin • vyvolává „hemizygotní“ stav a může sloužit pro zajištění přiměřené a vyrovnané výživy embryí, které se vyvíjejí v rámci mateřského organismu (= obrana proti vzniku paternálních alel vedoucích k nadměrné výživě embrya) • (u krytosemenných rostlin význam v determinaci velikosti endospermu)

38. Parentální imprinting imprint se ustavuje v průběhu meiozy (savci) či při vývoji gametofytu (rostliny) u savců v průběhu gametogeneze dochází k celkové demetylaci (resetu) a následné metylaci vybraných genů v závislosti na pohlaví u rostlin dochází k (rozsáhlejší) demetylaci jen v části gametofytu – v jeho „geneticky terminálních buň. liniích“: - v centrální buňce zárodečného vaku (DME - DEMETER) - ve vegetativním jádře pylové láčky (blokování DDM1, DME)

39. Epigenetické změny při vývoji pylu inhibici metylace (represe DDM1) ve vegetativním jádře pylové láčky, i aktivně DME pozn.: zřejmě není reprimováno přes H3K27me3! Primární účel: zřejmě pojištění správné metylace TE v generativních buňkách (spermatických buňkách): Demetylace – reaktivace TE – tvorba siRNA – transport do spermatických buněk – podpoření správné metylace TE

40. Epigenetické změny při vývoji zárodečného vaku pozn.: zřejmě není reprimováno přes H3K27me3! • Primární účel: • blokování TE a endospermově spec. genů • regulace velikosti endospermu • regulace hladiny transkriptů citlivých genů • blokování gametofytického vývojového • programu – umožnění vývoje embrya?

41. Represe exprese genů nezávislá na metylaci a sRNA: Proteiny PcG (POLYCOMB GROUP) - reprimovaný stav je udržován primárně di-(tri-)metylací histonu H3K27 - v růžici Arabidopsis asi 4 – 5 tis. genů! - udržování H3K27me2 zprostředkováno přítomností genově specifického Polycomb repressive complexu (PRC2) - udržování metylace po replikaci

42. př. vernalizace VRN2 (VERNALIZATION) PcG protein se váže po proběhlé vernalizaci spolu s dalšími faktory na promotor genu FLC, který brání kvetení v juvenilním stavu (navodí represi prostřednictvím H3K27me2) - represe FLC dovolí přejít do generativní fáze VIN3 – deacetylace histonů, VRN2 – vazba a indukce metylace histonu H3K27

43. Vernalizace – primární signál? VIN3 chromatin: - stále represivní H3K27me3 (PRC2) - transkripcí aktivační H3K36me3 a acetylace (? indukce rozpadem nukleozómu v místě počátku transkripce – teplotou?) - bivalentní značení chromatinu ( živočišné kmenové buňky) - kvantitativní odpověď

45. Prokázané formy mobilního umlčujícího signálu - na dlouhé vzdálenosti zatím 21nt miRNA a 24nt siRNA ?

46. Overview of miRNA-Mediated Gene Silencing. Pri-miRNAs are processed in the nucleus and mature miRNAs are exported to the cytoplasm. miRNAs are incorporated into AGO proteins and mediate posttranscriptional gene silencing through slicing or translational inhibition or alternatively through DNA methylation.... Rogers and Chen 2013