第 20 章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography ， HPLC)

1. 第20章 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)

2. 20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展 高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世，导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。 薄壳型填料，柱效仅每米1000~3000塔板数 5~10μm球型和无定型微粒硅胶，每米5~6万理论塔板数 键合相色谱、离子色谱、疏水色谱、亲和色谱、手性色谱、脂质体色谱、生物膜色谱、整体柱色谱、微径柱和毛细管柱色谱及液相色谱-质谱联用等

3. 20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展 高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世，导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。 薄壳型填料，柱效仅每米1000~3000塔板数 5~10μm球型和无定型微粒硅胶，每米5~6万理论塔板数 高度均匀甚至单分散1~3μm硅胶基质球形填料，达15~30万理论塔板/m。 新型分离模式和方法不断增加

4. 20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展 高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世，导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。 薄壳型填料，柱效仅每米1000~3000塔板数 5~10μm球型和无定型微粒硅胶，每米5~6万理论塔板数 高度均匀甚至单分散1~3μm硅胶基质球形填料，达15~30万理论塔板/m。 新型分离模式和方法不断增加

5. 20.1.2.高效液相色谱法的特点及与其他色谱法比较20.1.2.高效液相色谱法的特点及与其他色谱法比较 基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性 操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力 适用范围广

6. 20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系 1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 4. 体积排阻色谱(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。 根据固定相和液体流动相相对极性的差别，有正相色谱和反相色谱两种色谱体系或方法。 反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的相对极性，最初形成于液液分配色谱，现已广泛应用于其他各种色谱方法。

7. 20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系 上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各色谱方法在相关领域应用互相补充。

8. 20.2. 高效液相色谱仪 现代高效液相色谱使用3~10μm柱填料，为达到适用的流动相流速，高压泵需提供几十MPa或数百大气压力的柱前压。因而HPLC仪器比其他类型的色谱仪要复杂和昂贵。 1,2,3,--流动相溶剂储器；4,5,6,--过滤器；7—溶剂比例调节阀和混合室；8—输液泵；9—脉动阻尼器；10—放空阀；11—过滤器；12—反压控制器；13—进样阀；14—色谱柱；15—检测器。

9. 20.2. 高效液相色谱仪

10. 20.2.1.流动相贮器和溶剂处理系统 现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器，一般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特种塑料制成的容器。每个储瓶容积500~2000mL。储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排出。 储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置，这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣，防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。

11. 20.2.2.高压泵系统 通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系统密封性能好。 目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。 1.往复柱塞泵 1.电机，2.往复凸轮，3.密封柱塞，4.吸排液单向阀，5.溶剂入口，6.脉动阻尼器,7.接色谱柱。

12. 20.2.2.高压泵系统 2. 其他类型泵 气动放大泵又称为恒压泵，其工作原理与水压机相似，以低压气体作用在大面积气缸活塞上，压力传递到小面积液缸活塞，利用压力放大获得高压。 螺旋注射泵又称为排代泵，其结构类似于医用注射器，由一个大体积液体室和柱塞组成，步进电机通过螺旋杆传动机构推动柱塞输出高压液体。 3.流速控制和程序系统 比例调节阀和混合器；脉动阻尼器；放空阀；过滤器；反压控制传感器等。

13. 20.2.3.进样系统 进样阀 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

14. 动 画

15. 20.2.4.高效液相色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。

16. 20.2.4.高效液相色谱柱 1.色谱柱类型 按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。 2.保护柱 一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱，延长使用寿命。 3.柱恒温器 对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留值和更好分离色谱图。

17. 20.2.4.高效液相色谱柱 4. 柱填充技术 根据填料粒径大小采用干法或湿法装柱。粒径大于20μm，采用类似气相色谱的干法装柱，实际上这种方法己很少使用。 目前大多数采用10μm以下填料，以称为等密度匀浆湿法装柱。 注:1.高压泵，2.压力表，3.排空气阀，4.匀浆罐，5.色谱柱，6.加压介质瓶，7.废液杯。

18. 20.2.5.液相色谱检测器 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:

19. 20.2.5.液相色谱检测器 l. 光吸收检测器：紫外吸收检测器，光二极管阵列检测器，红外吸收检测器 2. 荧光检测器 3. 示差折光率检测器 4. 蒸发光散射检测器 5. 电化学检测器

20. 20.2.5.1.光吸收检测器 1. 紫外吸收(UV) 检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

21. 20.2.5.1.光吸收检测器 2.紫外光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。

22. 20.2.5.1.光吸收检测器 2.紫外光电二极管阵列检测器

23. 20.2.5.1.光吸收检测器 2.紫外光电二极管阵列检测器

24. 紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较 普通检测器 光电二极管阵列检测器

25. 20.2.5.1.光吸收检测器 3. 红外吸收检测器 与一般光吸收检测器光路设计相似，其吸收池窗口采用氯化钠、氟化钙等红外透明材料，透过吸收池的红外光一般以热电敏感元件接收。这种检测器可提供分子结构信息，但由于大多数液相色谱流动相溶剂都有红外吸收及窗口材料限制，其应用有限。

26. 20.2.5.2. 荧光检测器(Fluorescence Detector，FD) 高灵敏度、高选择性 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应.

27. 20.2.5.3. 示差折光检测器（Differential Refrative Index Detector, RI） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；

28. 20.2.5.3. 示差折光检测器（Differential Refrative Index Detector, RI） 示差折光检测器光路

29. 20.2.5.4. 蒸发光散射检测器(Evaporation Light Scattering Detector, ELSD) 1.色谱柱出口; 2.液压释放口; 3.氮气入口; 4.雾化器; 5.加热漂移管; 6.样品液滴; 7.激光光源; 8.排气口; 9.光电检测器; 10.放大器; 11.连接记录系统。 A.色谱柱洗出液雾化区；B.溶剂蒸发区;C.样品粒子光散射。

30. 20.2.5.5. 电化学检测器 基于电化学原理和物质的电化学性质进行检测，主要有安培、极谱及电导等几种类型，适用于测定具有电化学氧化还原性质及电导的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等。 1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或聚酯垫片,4.接参比电极，至废液，5.接色谱柱。

31. 20.3.高效液相色谱固定相和流动相 20.3.1. 高效液相色谱固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

32. 20.3.2. 液相色谱流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： 1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证柱的稳定性和分离的重现性。 2.适用的物理性质，包括沸点较低，以便于分离组分和溶剂回收;低粘度，利于提高传质速率和分离速度、降低柱前压;弱或无紫外吸收等，以降低UV检测器本低响应，提高检测灵敏度;对样品具有适当溶解能力等。 3.溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、价廉等，便于操作和安全。

33. 20.3.2. 液相色谱流动相 1.溶剂强度参数ε0 定义为溶剂分子在单位吸附剂表面积上的吸附自由能，表征溶剂分子对吸附剂的亲和力大小。 2.溶解度参数δ 它是溶剂与溶质分子间各种作用力的总和，包括色散力、偶极作用力、接受质子能力、给于质子能力等。 3.极性参数P’ 表示每种溶剂与乙醇、二氧六环和硝基甲烷三种极性物质相互作用力的度量，类似于气相色谱固定液的Rohrschneider常数，反映溶剂接受质子、给出质子和偶极相互作用能力及选择性差异，亦作为表征溶剂洗脱强度的指标。

34. 20.3.2. 液相色谱流动相

35. 20.3.2. 液相色谱流动相 优化保留值k和分离选择性α的重要方法是改变流动相溶剂类型和组成。 溶剂组成优化用差试法比较麻烦、费时，成功率不一定很高。采用溶剂组成与溶剂强度参数关系的估算,可减少优化实验操作。二元混合溶剂极性参数P’与其体积组成呈线性关系，可按算数平均值求出。例如溶剂A和B混合物的极性参数PAB’可按下式求出: 对极性吸附和正相色谱: 对于反相色谱:

36. 20.4.吸附色谱(Adsorption Chromatography) 20.4.1.液固吸附色谱固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。 在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。

37. 20.4.吸附色谱(Adsorption Chromatography) 20.4.1.液固吸附色谱固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。 在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。

38. 20.4.2．吸附色谱分离机理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:

39. 20.4.3.分离条件优化和应用 液固色谱一般较少考虑吸附剂类型。 常采用薄层色谱技术进行初步探索。 吸附剂含水量是控制吸附剂活性，影响溶质保留的重要因素。

40. 20.5.分配色谱(Partition Chromatography) 研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。 可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前者是早期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相，即化学键合固定相至载体或基质表面。 化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱类型。

41. 20.5.1.液液分配色谱 液液色谱固定相是将极性或非极性固定液涂渍在全多孔或薄壳型硅胶等载体表面形成的液膜。要求载体表面惰性，比表面积约50~250m2/g，比表面积不宜太高，以降低残余吸附效应。 固定液涂渍在载体上有两种方法：一种是静态法，以固定液溶液浸渍载体，然后用缓慢地蒸发除去溶剂；另一种是在位动态涂渍法，将载体填充在色谱柱中，然在将一定固定液浓度的流动相连续流经色谱柱，至固定液在载体和流动相中达到分布平衡，形成稳定色谱体系。

42. 20.5.2．键合相高效液相色谱 20.5.2.1.化学键合、化学吸附色谱固定相 1.键合相色谱固定相 键合固定相的性能指标有:(1).键合量:可以键合硅胶含碳量和表面覆盖率表示，其含碳范围5%~40%，表面覆盖率1-4μmol/m2。(2).按某指定k值溶质测定的理论塔板数。(3).色谱柱渗透性，可以柱前压度量。(4).两种不同溶质的分离选择性α。(5).保留值k的重现性。(6).色谱峰的对称性。(7).稳定性:耐溶剂和pH范围。 根据色谱体系固定相和流动相相对极性，可分为反相和正相键合相色谱。

43. 20.5.2.1.化学键合、化学吸附色谱固定相 2.化学吸附改性色谱固定相 其典型代表是新近以微粒氧化锆、氧化锆/氧化镁等为基质，通过路易斯酸碱化学吸附作用，制备长链烷基膦酸(C8-C18)及含极性基团衍生物的非极性和极性色谱固定相。 它们具有耐溶剂、耐酸碱(pH1-12)、化学稳定和适用范围广的特点，其色谱性能与键合硅胶固定相基本类似，而制备简便、适用碱性化合物、蛋白质等生物样品分离，是一类极具发展潜力的新型HPLC固定相。

44. 20.5.2.2.键合相色谱保留机理 反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶剂作用理论来解释。 这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的流水特性。 当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。

45. 20.5.2.2.键合相色谱保留机理

46. 20.5.2.3.反相色谱分离条件优化 • 固定相选择 • 改变非极性键合相烃基链长和键合量，链长增加导致溶质保留值k升高，但长链之间k和α差别较小，相同表面覆盖率C18柱保留略大于C8柱。 • 2. 流动相选择 • 改变流动相溶剂性质和组成，这是调节k和选择性α最简便、有效的方法。

47. 20.5.2.3.反相色谱分离条件优化 3.流动相pH值 流动相缓冲溶液pH值对离子性溶质保留有显著影响，pH值变化可导致k值10倍左右变化，视溶质离子化基团多少而异。 4. 衍生化技术 与气相色谱类似，HPLC也采用衍生化技术，特别是反相色谱，通过样品组分柱前衍生化可达到两个目的:一是降低溶质极性，提高疏水性;二是向溶质中引进检测响应，主要是紫外吸收、荧光激发基团，以提高检测灵敏度或高选择性检测响应。溶质柱后衍生化则只有利于提高检测灵敏度。

48. 20.5.2.4.键合相色谱应用实例 相对分子质量<10000的脂溶性样品一般采用反相色谱分离。 图20-19. 邻苯二甲醛柱前衍生化氨基酸RPC分离色谱图

49. 20.5.2.4.键合相色谱应用实例 相对分子质量<10000的脂溶性样品一般采用反相色谱分离。 图20-20.极性氨基柱反相条件下分离糖类化合物物

50. 20.5.3.离子对色谱(Ion-Pair Chromatography) 在色谱体系中引入一种与样品溶质离子电荷相反的离子对试剂，通常称为对离子或反离子(counterion)，它与溶质离子形成离子对，从而改变溶质在两相中的分配，使离子性溶质的保留行为和分离选择性发生显著变化。 常用的离子对试剂有提供阴离子的C4 - C8烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、羧酸盐、萘磺酸盐、高氯酸盐等;提供阳离子的季铵盐和烃基胺，如四丁基铵盐、十六烷基三甲基铵盐、三乙胺等。 将离子对试剂涂渍在液液色谱的硅胶载体上或溶于流动相中，可构成液液离子对分配色谱，由于固定相的流失，这类离子对色谱应用不多。 在反相色谱中，离子对试剂加入缓冲液和甲醇、乙腈等极性有机溶剂的流动相构成反相离子对色谱。