730 likes | 963 Views
Seente geneetika II. Heidi Tamm 5. märts 2010. Suguline paljunemine Seened mudelorganismidena Tetraadide analüüs Komplementatsiooni test S. cerevisiae genoom Proteoomika. Suguline paljunemine. Et saada maksimaalset kasu, peaksid ühinevate rakkude tuumad olema nii erinevad kui võimalik
E N D
Seente geneetika II Heidi Tamm 5. märts 2010
Suguline paljunemine • Seened mudelorganismidena • Tetraadide analüüs • Komplementatsiooni test • S. cerevisiae genoom • Proteoomika
Suguline paljunemine • Et saada maksimaalset kasu, peaksid ühinevate rakkude tuumad olema nii erinevad kui võimalik • Tsütoplasmad peaksid olema nii sarnased kui võimalik (et vältida geneetilist saastust) • Vegetatiivne vs. seksuaalne kokkusobivus
Isane või emane? • ei ole võimalik eristada • seened on hermafrodiitsed
Vegetatiivne kokkusobivus • Heterokaarüonid tekivad vaid samasse vegetatiivse kokkusobivuse gruppi kuuluvate hüüfide vahel • Kui hüüfid ei ole kokkusobivad, siis vahetult kontakteeruvad rakud surevad
Vegetatiivne kokkusobivus/sobimatus • Liitumise kokkusobimatus (fusion incompatibility) - kokkusobivussüsteem määrab ära rakkude võime liituda. (hallitusseentel) • Liitumisejärgne kokkusobimatus (post-fusion…) – määrab ära, kas rakud jäävad pärast liitumist ellu; kas koos tsütoplasmaga saavad migreeruda ka tuumad jm. organellid
Ristumissüsteemid • On määratud tuuma geenide poolt, mis takistavad kahe geneetiliselt identse mütseeli ristumist • Heterotallism – süsteem, kus on takistatud ristumine kahe identse gameedi vahel • Homotallism – kui miski ei takista identsete gameetide ristumist
Heterotallism • anastomoos on võimalik ainult kahe erineva talluse vahel • 90% kandseentest
Homotallism • suguline paljunemine saab toimuda ilma interaktsioonita kahe talluse vahel • iseviljastumine • primaarne vs. sekundaarne homotallism
Primaarne homotallism • idaneb ühetuumaline eos, moodustub kahetuumaline mütseel • tuumad on ühesugused • moodustuvad viljakehad
Sekundaarne homotallism • kui peale meioosi satub ühte eosesse 2 tuuma
Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne • unifaktoriaalne ehk bipolaarne • ristumist kontrollib üks lookus kahe alleeliga • alleelide lahknemine meioosis tagab, et ühes eoses on vaid üks alleel. Edukalt ristuvad vaid rakud, millel on ristumistüübi lookuses erinevad alleelid.
Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne • kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 50% juhtudest • kottseened, ikkesseened • rooste- ja nõgiseened
Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne • Kaks omaette ristumistüübi lookust (A ja B). • Bifaktoriaalne e. tetrapolaarne • Edukaks ristumiseks on vaja erinevaid alleele mõlemas lookuses
Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne • Populatsioonis võib olla palju erinevaid alleele kummagi lookuse kohta • 55% kandseentel Kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 25% juhtudest
Ristumisfaktorid: bifaktoriaalne • “A” geen kodeerib homeodomääni valke (transkriptsioonifaktoreid) • “B” geen kodeerib feromone ja nende retseptoreid • kummalgi geenil on alamlookused
S. cerevisiae ristumistüübi faktorid • 2 ristumistüüpi: a ja α • Ristumistüüp määratud: • peptiidhormoonide (feromonide) poolt (α- ja a-faktorid) • feromonispetsiifiliste retseptorite poolt
Kuidas ristumistüübi faktorid toimivad? • Feromon seostub vastastüüpi raku pinnal oleva retseptoriga. Selle sündmuse tagajärjed: • rakus algab aglutiniini tootmine, nii kleepuvad rakud kokku • mõlema raku kasv peatub G1 faasis • muutub rakuseina struktuur ja raku kuju
a-tüüpi rakkudes produtseeritakse: • a-feromoni • α-feromoni retseptorit • ja vastupidi
MAT lookus • Lookuses on 2 geeni (a1 ja a2 või α1 ja α2) • MATa1 represseerib a-feromoni retseptori ja α-feromoni sünteesi • MATa2 funktsioon teadmata • MATα1 aktiveerib a-feromoni retseptori ja α-feromoni sünteesi • MATα2 represseerib α-feromoni retseptori ja a-feromoni sünteesi
Kui tuumad on ühinenud: • Diploidid on alati MAT lookuse suhtes heterosügootsed • a1 ja α2 valgud moodustavad heterodimeeri, mis aktiveerib meioosi ja sporulatsiooni ja represseerib haploidsed funktsioonid
Et asi oleks tõeliselt segane... • Pärmi haploidsed rakud saavad oma ristumistüüpi muuta • Kontrollib geen HO (endonukleaas) • Dominantse alleeli korral toimub see peale igat raku jagunemist HML MAT HMR
(kott)seened mudelorganismidena • Saccharomyces cerevisiae • Aspergillus nidulans • Schizosaccharomyces pombe • Neurospora crassa
Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism • Eukarüoot • Lihtne kasvatada • Väike genoom kergestimanipuleeritav • Kasvab kiiresti • Mutantide isoleerimise lihtsus • Hästidefineeritud geneetiline süsteem • Rekombinatsioon kõrge sagedusega
Saccharomyces cerevisiae kui mudelorganism • Mitmekülgne DNA transformatsiooni süsteem • Nii haploidne kui ka diploidne faas stabiilne • Mittepatogeenne • Metaboolsed ja regulatoorsed mehhanismid kõrgelt konserveerunud • Inimeste haigustega seotud geenide ortoloogid • ...
Pärm: milliseid protsesse uuritakse? • Geeniregulatsioon • raku koostisosade biosüntees • mRNA translatsioon • valkude post-translatsiooniline modifitseerimine • valkude sekreteerimine • mitokondri biogenees • võõrgeenide ekspressioon
Pärm: mida uuritakse? • Rakutsükli regulatsioon • Signaaliülekande mehhanismid • Kromosoomi struktuur • DNA replikatsioon • Genoomika
Neurospora ja Aspergillus Haploidne vegetatiivne faas ja haploidsed koniidid - seeneniidistiku fenotüübi järgi saame teha järeldused genotüübi kohta
Neurospora ja Aspergillus • Iga eoskott sisaldab 8 eost • peale meioosi toimub mitoos • 2n tuuma iga üksik DNA ahel läheb ühe eose tuuma • võimaldab algse DNA detailset analüüsi • isegi heterodupleksi erinevused tulevad välja (osaline erinevus kaksikheeliksi ahelates)
Magnaporthe grisea • Riisi närbumistõve tekitaja (rice blast fungus) • Genoomi suurus 40.3 Mb • 7 kromosoomi • 10% genoomist kordusjärjestused (> 200 bp) • retrotransposoonid • sagedane rekombinatsioon
Magnaporthe grisea apressor koniid
Magnaporthe grisea • rekombinatsioonide tõttu genoom muutlik • looduses paljuneb mittesuguliselt • genoomi muutlikkus on seenele kasulik: • peremehespetsiifilisuse muutumine kui kaotsi lähvad geenid, mis põhjustavad potentsiaalses peremehes kaitsereaktsioone
Seente transformatsioon • Katsetatud paljudel seentel • Head protokollid olemas üksikute jaoks: • Saccharomyces • Aspergillus • Neurospora • Ustilago
Võimalused transformatsiooniks • Protoplast • Terve raku töötlemine Ca2+ ja Li+ ioonidega • Elektroporatsioon • Geenipüss (gene gun, particle bombardment)
Mida on vaja transformatsiooni läbiviimiseks? • Vektor, milles meid huvitaval geenil on sobiv promootor ja terminaator • Seenerakud peavad olema kompetentsed • Selektsioonisüsteem • (Protoplastidest tuleb regenereerida mütseel)
N. crassa – tetraadide analüüs • Eoskotid kui korrastatud tetraadid - alleelide kombinatsioon eostes vastab meioosi I ja II jagunemisele • meioos I - kahe (homoloogilise) kromosoomi lahknemine • meioos II - kahe tütarkromatiidi lahknemine
Tetraadide analüüs • Saab jälgida rekombinatsiooni toimumist ja kindlaks teha aheldatuse gruppe • Kottseened sobivad geenide meiootiliseks kaardistamiseks • Pärmil on eoskotis 4 eost, mis on ühe meioosi tulemus • Mitme alleeliga geenide aheldus • Lookuse asukoht tsentromeeri suhtes
Tetraadide analüüs tänapäeval • Et kindlaks teha mutatsiooni, mis vastab konkreetse lookuse muutmisele • Et konstrueerida uusi tüvesid • Et kindlaks teha geenide interaktsioone
Erinevad tetraaditüübid. Ristati AB × ab Eri tüüpide osakaal näitab, kas A ja B on aheldunud
Auksotroofid • Auksotroofsed mutandid, kes pole ühe geeni muteerumise tõttu võimelised kasvama teatud söötmel • Kasv taastub, kui söötmele lisada vajalik komponent Esineb spetsiifiline sõltuvus konkreetse geeni produkti ja metaboolse sammu vahel. “Üks geen - üks valk” hüpotees
Auksotroofne organism sisaldab mutatsiooni, mis muudab organismi toitumisvajadusi • Prototroof – metsiktüüpi organism muutmata toitumisvajadustega
Pärmi auksotroofsed markerid • Aminohapped • Leu • His • Trp • Nukleotiidid • Uratsiil • Adeniin Selektsioonivahend molek. geneetiliste katsete puhul
Mis on komplementatsioon? • Kahe auksotroofi ristamisel saadud diploid on prototroof, kui defektid on erinevates lookustes • Alleel, mis ühes haploidis on mutantne (retsessiivne), on teises haploidis funktsionaalne (dominantne) • Mõlema haploidi wt alleelid kompenseerivad teise haploidi defektse alleeli
Mis on komplementatsioon? • Kui defektid on samades lookustes, siis kahe auksotroofi ristamisel tekkiv diploid on auksotroof • Retsessiivne homosügoot • Ka eri liikidelt pärit geenid võivad üksteist täiendada
Komplementatsiooni test • Haploidsete auksotroofide genotüüpide kindlakstegemiseks • Tundmatu genotüübiga haploid ristatakse teadaolevate genotüüpidega haploididega • peavad olema erineva ristumistüübiga
Komplementatsioonigrupid • Kui defektsete tüvede ristamisel ei toimu komplementatsiooni, kuuluvad nad samasse gruppi • Iga grupp esindab ühte ensüümi biokeemilises rajas • Suuremahulised projektid võimaldavad identifitseerida kõik kompl. grupid => kõik geenid metaboolses rajas Geeni defineerimine toime järgi
Alati pole kõik nii ilus… • Kahe lookuse suhtes heterosügootne diploid võib fenotüübilt olla ikkagi defektne • Alleelne ehk geenisisene komplementatsioon – mutatsioonid on mõlemas tüves samas lookuses