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LMA – Diagnóstico laboratorial Nydia S. Bacal

LMA – Diagnóstico laboratorial Nydia S. Bacal. LMA – OMS Leucemia Promielocítica Aguda LMA M3 clássica LMA M3 variante. Classificação da OMS. LMA 99P - LMA12. Robin Foá – Atibaia 03/2007. Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007. LMA não categorizada.

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LMA – Diagnóstico laboratorial Nydia S. Bacal

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Presentation Transcript

  1. LMA – Diagnóstico laboratorialNydia S. Bacal LMA – OMS Leucemia Promielocítica Aguda LMA M3 clássica LMA M3 variante

  2. Classificação da OMS

  3. LMA 99P - LMA12 Robin Foá – Atibaia 03/2007

  4. Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

  5. LMA não categorizada • > 60% dos casos de LMA • Base para classificação é a morfologia, grau de maturação e citoquímica • Não existem anormalidades citogenéticas recorrentes • O critério diagnóstico é ≥20% de blastos na MO (em 500 células) ou SP (200 leucócitos) • Se houver leucopenia acentuada pode se fazer esfregaços do buffy coat • Biópsia de MO é necessária para o diagnóstico de leucemia aguda hipocelular em S.P. e M.O. • Recomendações para classificação são aplicáveis apenas em amostras obtidas antes da quimioterapia.

  6. IMUNOFENOTIPAGEM • Fundamental para o diagnóstico de: • LMA-M0 • LMA-M7 • Pode ser importante no diagnóstico de: LMA-M6b (Leucemia eritróide pura) • LMA-M3 (hipogranular)

  7. Diagnóstico Laboratorial LMA e LPA – LMA M3 • Diagnóstico na rotina PML-RARα qualitativo PCR e FISH – HIAE PML-RARα quantitativo - Nichols– 72horas(s/ estabilidade) FLT3 qualitativo – Nichols NPM – Exon 12 – Nichols C-Kit – qualitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade) CBFβ MHY11 (inv 16) – Quali/quantitativo– Nichols – 72horas(s/ estabilidade) FISH – envio de células AML1-ETO (t:8;21) – Quali e quantitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade) FISH – HIAE MLL PTD 11q23 - FISH – HIAE Não Disponíveis: t(11;17) PLZF-RARα/NuMA- RARα/ t(5;17)NPM-RARα/ t(17;17)STSTSb-RARα CEBPα ; BAALC ; ERG ; NRAS ; • Valor Prognóstico e Futuro

  8. FormaClássica - LPA - LMAM3 Faggot Cells Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

  9. Forma Variante LPA - M3v S. P.

  10. Forma Variante LPA - M3v MO Citoquímica para MPO – deve ser fortemente positiva Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

  11. Forma Hiperbasofílica Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

  12. Diferenciação Granulocítica – MO normal Painéis de anticorpos monoclonais I II III IV V I II III IV V I II III IV V Mieloblasto Pro- Mielócito Meta- Neutrófilo mielócito mielócito Bastão CD34 CD117 HLA-DR CD117 CD13+forte CD33+forte CD13+forte CD33+forte CD13+fraco CD33+fraco CD13+ CD33+fraco CD13+forte CD33+fraco CD15 CD15 CD11b CD15 CD11b CD16 CD15 CD11b+forte CD16+forte CD34/CD117/CD45/CD13.33 CD16/CD13/CD45/CD11b Dra. Maria Silvia – Florianópolis Santa Catarina

  13. Imunofenotipagem Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

  14. LMA M3 CD45xSS CD2xCD45 CD34xCD45 MPO(c)xCD45 CD56xCD45 HLA-DRxCD45 CD33xCD45 CD13xCD45 CD117xCD45 CD71xCD45

  15. IMUNOFENOTIPAGEM • Antígenos mielomonocíticos (CD13, CD15 e CD33) e ausência de expressão de antígenos monocíticos (CD14, incluindo My4, Leu M3 e Mo2) e ausência de HLA-DR • Estudos iniciais - ausência de CD34 e CD7,mas Edward et al (1999) observaram que 41% dos casos de LPA com CD34 (+). • HLA-DR (+) em LPA e HLA-DR (-) em LMA com morfologia não M3 Dr. Alberto Orfao – Universidade de Salamanca

  16. LMA - TRIAGEM FENOTÍPICA DE ALTERAÇÕES GENÉTICAS t(8;21) MPO+, CD13, CD33, CD19+, CD56+ Comumente LMA-M2 t(15;17) MPO+, CD13+ heterogêneo, CD33++ homogêneo, CD15-, CD34-, HLA-DR- LMA Promielocítica – FAB M3 Orfao, A et al, Haematologica, 84:405, 1999 Hurwitz, CA et al, Blood, 80: 3182, 1992

  17. 111 casos de LMA de novo • 38 morfologia de M3 (34 morfologia típica e 4 M3v) • PML-RARα - 39 dos 111 (35%) • 34 morfologias M3 e 5 casos foram classificados como M0 (2 casos), M1(1 caso) e M2 (2 casos)

  18. ORFAO et al • Quatro grupos conforme Morfologia / genética molecular 1) M3 / PML- RARα + (n=34) 2) Não-M3 / PLM-RARα + (n=5) 3) M3 com PML- RARα - (n=4) 4) Não-M3 / PML- RARα – (n=68)

  19. ORFAO et al • CD33 homogêneo nas células blásticas em 82% dos casos • CD13 em todas as células leucêmicas com padrão heterogêneo de expressão (100%) • Expressão de CD34/CD15 (100%) • Discriminação entre M3/PLM-RARα (+) e M3/PLM-RARα (-) : ٭padrão fenotípico CD34/CD15 ٭expressão de CD13 ٭presença de subtipo maior de células blásticas.

  20. ORFAO et al • A sensibilidade da imunofenotipagem para selecionar casos PLM-RARα foi de 100% e especificidade 99% • HLA-DR negativo é provavelmente o achado mais específico ( 91%)

  21. 80% Blasti CD33+ APL N molecole CD33/cell = 23017 O 0 256 512 768 1024 0 1 2 3 4 10 10 10 10 10 FSC-Height -> CD33 PE -> Spalice R. MO 14/11/02.003 Spalice R. MO 14/11/02.003 AML M4 0 1 2 3 4 10 10 10 10 10 0 256 512 768 1024 FSC-Height -> Petriconi R. MO 30/12/02.003 Expressão e quantificação do CD33 em LMA / LPA 80% Blasti CD33 + N molecole CD33/cell =1648 O FL3-H -> Petriconi R. MO 30/12/02.003 70% Blasti CD34+ CD33+ AML M2 N molecole CD33/cell = 2992 O 0 1 2 3 4 0 256 512 768 1024 10 10 10 10 10 Robin Foá – Atibaia – 03/2007 FSC-Height -> CD34 FITC -> Caboni ext 19/12/02.003 Caboni ext 19/12/02.003

  22. LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA) • LPA é caracterizada por uma translocação específica t(15;17) • t(15;17) envolve o gene receptor do ácido retinóico RAR-alpha no cromossomo 17 e o gene PML, um fator de transcripção, no cromossomo 15, gerando o gene quimérico PML-RAR-alpha • o resultado da proteina quimérica PML/RARα é crucial para a patogênese da LPA Dr. Zago – Atibaia 03/2007

  23. SLD de acordo com o grupo de risco citogenético-molecular Median: Standard: 3.2 years (C.I. 95%: 38,6 - 60,6) Intermediate: 1.6 years (C.I. 95%: 36,9 - 63,1) High: 0.62 years (C.I. 95%: 39,2 - 59,7) standard-risk: median DFS = 3.2 years intermediate-risk: median DFS = 1.6 years high-risk: median DFS = 0.62 years p<0.0001 years from CR standard: 85 events 47 intermediate: 56 events 34 high: 91 events 75 Mancini et al, Blood 2005

  24. Genes X Genes X-RAR Translocações Cromossômicas Envolvendo o Gene RARα Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

  25. Estrut. Alvo Método T Vantagem Desvantagem Cromossomos t(15;17) Cariótipo 13-14 dias Específico Crescimento em cultura; fusões crípticas não são detectadas, não define alvo para MRD FISH 2-3 dias Céls. intérfase Custo, não define alvo para MRD DNA genes PML e RARα Southern 7 dias Específico Laborioso, uso de radioativos, não define alvo para MRD RNA fusão PML/RARa RT-PCR 1 dia Rápido, sensível, define alvo p/ MRD Qualidade do RNA, falsos positivos Núcleo Proteína PML Imunofluores. 1 dia Rápido, barato Artefatos, não define alvo para MRD MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

  26. RAR PML RA RXR RAR PML DR5 5’ 3’ Imunofluorescência anti-PML LMA – não LPMa Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

  27. Gene Mutation Frequency FLT-3 Duplication 15-30% Point Mutation 5-10% FMS Point Mutation 10-20% c-KIT Various <10% Acute Myeloid Leukemia Tyrosine Kinase Receptor Mutations

  28. Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

  29. FLT3 wildtype FLT3 mutation p<0.001 1 2 3 4 5 6 years Core Binding Factor AML Prognostic impact of TK receptor mutations 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 E F S (%) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  30. FLT3 wildtype FLT3 mutation 1 2 3 4 5 6 years c-KIT wildtype c-KIT mutation 1 2 3 4 5 6 years Core Binding Factor AML Prognostic impact of TK receptor mutations 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 E F S (%) p<0.001 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 O S (%) p=0.03 Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  31. LMA. Carcaterísticas clínicas de acordo com o status FLT3 FLT3 pos FLT3 neg 582 Pts 150 (20%) 16-60 (40.5) Idade(mediana) 15-60 (48.5) 290/292 Sexo F/M 86/64 1.0-170 (28.2) G.B.(mediana) 10.1-410 (126.0) 12-98 (46) Blastos (%) 50-100 (85) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  32. Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  33. Ac Ac NLS NLS NPM 1 Kb Exon 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 10 12 Oligomerization Heterodimerization MB Mutations None (wild type) GATCTCTG....GCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation A (77%) GATCTCTGTCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation B (13%) GATCTCTGCATGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation C (2%) GATCTCTGCGTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation D (2%) GATCTCTGCCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation E (2%) GATCTCTG....GCAGTCTCTTGCCCAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation F (2%) GATCTCTG....GCAGTCCCTGGAGAAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Pelo menos 40 variantes da mutação NPM já foram identificadas Falini et al., NEJM 352: 254-266, 2005

  34. 86 47 NPM MUTANTS LOCALIZE ABERRANTLY IN THE CYTOPLASM NIH 3T3 NPM wild-type NPM-mutated GFP NPMwt GFP NPMm C Mutated WT WB: anti-NPM (376) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  35. Tratamento: Fatores Prognósticos • Pacientes idosos (>60 anos ? ; >80 anos) • Sanz et al (PETHEMA+GIMEMA) • Baixo risco: GB<10.000/μl e Plt>40.000/ μl • Alto risco: GB≥10.000/ μ l • Risco intermediário:GB<10.000/ μl e Plt<40.000/ μl • Persistência do PML/RARα pós-consolidação • Mau prognóstico mas não modificam o tratamento: CD56+, isoforma S do PML/RARα e mutações do FLT3 • Não são fatores de mau prognóstico: anormalidades citogenéticas adicionais (30%) Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

  36. 1 RT-PCR positive 0.8 0.6 Probability p=0.0001 0.4 0.2 RT-PCR negative 0 0 12 24 36 48 Months GIMEMA-AIEOP “AIDA” Trial Risco de recaída de acordo com monitoramento precoce de RT-PCR após consolidação Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  37. Sobrevida da LPA em pacientes tratados por recaída hematológica vs molecular 1.0 Molecular 0.8 0.6 Hematologico 0.4 P = 0.01 0.2 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 32 20 7 2 94 47 26 14 Robin Foá – Atibaia 03/2007

  38. Expressões gênicas em LMA: grupos moleculares e resultados 54 AML pediatric samples with a different signature that is associated with outcome (Yagi, 2003, Blood) Clear correlation between cytogentic groups and gene expression (Kohlmann, 2003, Genes, Chrom Cancer) Identification of a HOX signature in samples with normal cytogenetics (Debernardi, 2003, Genes, Chrom Cancer) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  39. Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

  40. Morphology Cytogenetics Immunophenotyping PCR Cytochemistry FISH AmpliChip LeukemiaMILE: Clinical Objectives Objective 1: Clinical accuracy of the microarray test as compared to standard leukemia laboratory methods (“gold standard”) n = 4000 patients Gold standard Diagnostic Information Microarray-based gene expression profile Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  41. AmpliChip LeukemiaThe “MILE” multi-center pre-marketing study MicroarrayInnovations inLEukemia A retrospective and prospective study to compare laboratory standard leukemia tests with a new microarray-based gene expression test Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  42. AmpliChip LeukemiaKey hematological centers participating in Phase-I The MILE study will be conducted in collaboration with the European Leukemia Network plus US participants European Leukemia Network (WP13) Principal Investigator: T. Haferlach • Site 1 Montpellier / France • Site 2 Munich / Germany • Site 3 Berlin / Germany • Site 4 Rome / Italy • Site 5 Padua / Italy • Site 6 Salamanca / Spain • Site 7 Cardiff / UK US Sites – Memphis, La Jolla Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  43. Classification performance of 17 - class algorithm: MDS not included in data set Accuracy by cross-validation: 95.65% • based on 30fold CV • HG-U133 Plus 2.0 • 2,647 samples for training Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  44. AmpliChip Leukemia TestMILES Stage I data presented at ASH conference 2006 [852] An International Multi-Center Microarray Study for the Molecular Classification of Leukemia Identifies Novel Sub-Groupings in MDS Overlapping with AML. Session Type: Oral Session Authors: Ken I. Mills, Torsten Haferlach, Jesus M. Hernandez, Wolf-Karsten Hofmann, Alexander Kohlmann, Mickey Williams, Lothar Wieczorek Date/Time: Tuesday, December 12, 2006 - 8:45 AM Session Info: Simultaneous Session: Myelodysplastic Syndromes: Molecular Biology (8:00 AM-10:00 AM) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

  45. Illumina

  46. AML-1 (21q22) Core Binding Factor Genes Proteins  Subunity (direct contact with DNA) CBF  Subunity (promotes interaction with DNA) CBF

  47. rhd AML-1 (21q22) Runt homology domain (RUNX1) CBF (16p13) Core Binding Factor Genes Proteins  Subunity (direct contact with DNA)  Subunity (promotes interaction with DNA) CBF

  48. CBF-MHY11 inv (16) ETO rhd rhd rhd MYH11 AML1-ETO t(8;21) CBF CBF CBF Core Binding FactorTranslocations in AML Wild type

  49. 5-12% AML 8 t(8;21) 21

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