1 / 20

FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche

FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche. Clonaggio, espressione e purificazione della MAP chinasi 7 di Arabidopsis thaliana Candidato: Camilla Badiali 1470854 Relatore: Dott.ssa Maria Rosaria Fullone Anno accademico 2013/2014.

kaye-ball
Download Presentation

FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALICorso di Laurea triennale in Scienze Biologiche Clonaggio, espressione e purificazione della MAP chinasi 7 di Arabidopsisthaliana Candidato: Camilla Badiali 1470854 Relatore: Dott.ssa Maria Rosaria Fullone Anno accademico 2013/2014

  2. COSA SONO LE Mitogen-ActivatedProteinKinase? • Sono presenti in tutti gli eucarioti (animali, piante e funghi) • Sono chinasi serina/treonina prolina-dirette che fosforilano substrati contenenti il motivo consenso YX [S/T] P, dove Y rappresenta una prolina o un amminoacido alifatico • Cascate di MAPK mediano la trasmissione e l'amplificazione degli stimoli extracellulari • Quando la risposta deve essere interrotta le MAPK sono defosforilate e quindi disattivate da fosfatasi MKKK

  3. LE MAPK NELLE PIANTE Nelle piante le cascate di MAPK e più in generale i sistemi basati sulla fosforilazione/defosforilazione sono molto importanti per la risposta rapida ai cambiamenti dell’ambiente esterno • Circa il 10 % di tutte le chinasi vegetali è coinvolto in cascate di MAPK • In Arabidopsisthalianala sequenza del genoma ha rivelato l’esistenza di 23 geni che codificano per MAPK e 10 per le MAPKK • Le MAPK vegetali sono coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare, nella risposta a stress abiotici, nella risposta a ormoni e all’attacco patogeno

  4. MPK7 di Arabidopsisthaliana • Appartiene ad una cascata di MAPK coinvolta nella risposta ai patogeni in Arabidopsisthaliana • È attivata dalla MAP chinasichinasi 3 (MKK3) • Interagisce con la 14-3-3 omega, come evidenziato in un lavoro di proteomica(Chang et al., 2009)

  5. COSA SONO LE PROTEINE 14-3-3? • Sono proteine dimeriche leganti fosfoserina o fosfotreonina che regolano le attività di una vasta gamma di target tramite interazione diretta proteina-proteina • L’interazione con i loro bersagli è promossa dalla fosforilazione della sequenza consenso sulla proteina bersaglio; le sequenze consenso sono di tre tipi: -modo 1 (K/RXXSp/TpXP) -modo 2 (K/RXXXSp/TpXP) -modo 3 (YTpV) (dove X rappresenta qualsiasi amminoacido mentre la Sp/Tp sono serina o treonina fosforilate) • Sono proteine regolatrici ubiquitarie degli organismi eucarioti che hanno un ruolo nella regolazione del ciclo cellulare, differenziamento, apoptosi e il coordinamento di molteplici vie di trasduzione del segnale

  6. OBIETTIVO L’obiettivo di questo lavoro era verificare in vitro l’interazione tra MPK7 e 14-3-3 omega

  7. INTERAZIONE in vitro DI MPK6 DI MAIS CON 14-3-3 In vitro: è stato dimostrato che la MAP chinasi 6 di mais, ZmMPK6, è in grado di interagire con le proteine 14-3-3: Il saggio di overlay, utilizzando come sonda una 14-3-3 marcata con 32P, ha mostrato una dipendenza dell’interazione dalla fosforilazione Il pull down assayha dimostrato l’interazione tra la MPK6-Hisx6 e la GST-14-3-3 immobilizzata su resina di glutatione-sefarosio-4B (Lalle et al., 2005)

  8. CLONAGGIO DELLA MPK7 Il frammento di DNA codificante la MPK7 è stato: • Amplificato mediante PCR a partire da una preparazione di cDNA totale ottenuta per retrotrascrizione con oligodT da RNA totale diArabidopsisthaliana • Estratto dal gel di agarosio • Clonato in pGEM-T • Sequenziato • Il plasmide pGEMT-mpk7 è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e XhoI • Il frammento di cDNA ottenuto è stato clonato nel vettore di espressione pGEX-6P-1 precedentemente digerito con gli stessi enzimi • Il costrutto pGEX-6P-1-mpk7 è stato trasferito nel ceppo BL21 (DE3) Il plasmide pGEX-6P-1 permette l’espressione di proteine ricombinanti fuse alla GST mpk7

  9. ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DELLA MPK7 GST-MPK7 97 kDa • Per trovare le condizioni sperimentali migliori, l’induzione della coltura con IPTG è stata condotta a diverse temperature e la migliore si è rivelata essere 30 °C • La coltura è stata sonicata ed è stato eseguito un western blottingcon anticorpi anti-GST del lisato cellulare per verificare la quantità di GST-MPK7 presente 85 kDa 66 kDa 50 kDa GST-MPK7 35kDa 30 kDa • La proteina solubile ottenuta in queste condizioni è purificata attraverso cromatografia di affinità su una resina di glutatione-sefarosio-4B e analizzata su gel di poliacrilammide 25 kDa GST 21 kDa Induzione a 30 °C Induzione a 16 °C Induzione a 37 °C

  10. DIGESTIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE GST-MPK7 • la chinasi ricombinante viene digerita utilizzando la proteasi PreScissionche riconosce una specifica sequenza e separa la GST dalla MPK7 97 kDa 66 kDa GST-MPK7 45 kDa MPK7 30kDa GST 21 kDa

  11. ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DELLA 14-3-3ω-Hisx6 • L’espressione della proteina 14-3-3ω-Hisx6 è stata indotta a 30 °C con IPTG • La coltura viene sonicata • Il lisato cellulare viene purificato attraverso una cromatografia d’affinità su resina contenente cobalto • La proteina purificata è sottoposta a corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide 97 kDa 66 kDa 45 kDa 14-3-3ω-Hisx6 30 kDa 21kDa

  12. L’INTERAZIONE TRA MPK7 E LA 14-3-3 OMEGA MPK7 possiede una sequenza consenso fosforilabile T E Y che deve essere fosforilata perché si attivi MPK7 presenta una sequenza consenso per il legame con la proteina 14-3-3 omega R F I K S L P

  13. Studio di interazione in vitro della MPK7 con la14-3-3ω-Hisx6 : saggio di overlay Il saggio di overlayè una tecnica che consiste in una parziale modificazione del western blotting I campioni proteici (MPK7) da analizzare sono: • separati mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide • trasferiti su membrana di nitrocellulosa • incubati con la 14-3-3ω-Hisx6 utilizzata come sonda • incubati con anticorpi anti-poliHis per rivelare l’avvenuta interazione

  14. CONCLUSIONIIl risultato ottenuto non ha dato un esito che permette di confermare con sicurezza l’interazione tra la MPK7 e la 14-3-3ω-Hisx6 72 kDa È possibile osservare una banda d’interazione tra la 14-3-3ω-Hisx6 e una proteina presente sulla membrana di nitrocellulosa nelle linee contenenti i campioni di GST-MPK7 e GST-MPK7 digerito con proteasi PreScission entrambi fosforilati, mentre non si osserva alcuna interazione con la GST-MPK7 non fosforilata. L’incertezza del risultato risiede nel fatto che la banda evidenziata nel risultato del saggio non possiede il peso atteso di 70 kDa(GST-MPK7) o 40 kDa(MPK7) ma ha un peso inferiore pari a circa 35 kDa. 14-3-3ω-Hisx6 e..? 35kDa 26kDa GST-MPK7 fosforilata GST-MPK7 digerita e fosforilata GST-MPK7 non fosforilata

  15. CONCLUSIONI La nostra ipotesi è che la proteina con cui la 14-3-3 ha interagito: • Non sia MPK7 • MPK7 parzialmente degradata Per validare il risultato si potrebbe: • Utilizzare una sonda più sensibile (14-3-3 marcata con 32P) • Effettuare un pull down assay • Verificare l’attività di MPK7 • Studiare l’interazione in un organismo eucariotico

  16. LE MAPK INTERAGISCONO CON LE 14-3-3 SIA in vivo CHE in vitro In vivo: è stata dimostrata un’interazione tra la 14-3-3 omega e la MPK7 attraverso uno studio di proteomica La 14-3-3 omega è stata: • Ingegnerizzata con una con una TAP tag “tandem affinitypurificationtag” che conteneva le sequenze codificanti per la proteina A e un peptide esaistidinico • Espressa in Arabidopsisthaliana I complessi proteici formati da 14-3-3 e le sue proteine target sono stati: • Purificati mediante due successive cromatografie di affinità - IgGsefarosio - Ni-NTA sefarosio • Separati tramite elettroforesi bidimensionale • Digeriti con tripsina I peptidi sono poi identificati tramite spettrometria di massa

  17. LE MAPK INTERAGISCONO CON LE 14-3-3 SIA in vivo CHE in vitro In vitro: è stato dimostrato che la MAP chinasi 6 di mais, ZmMPK6, è in grado di interagire con le proteine 14-3-3 attraverso saggio di overlay e pull down assay. • SAGGIO DI OVERLAY • La proteina 14-3-3 è stata: • Espressa nel vettore pGEX-2T-K contenente una sequenza codificante per la GST e una sequenza consenso fosforilabile per la PKA (ProteinKinasi A) • Fosforilata con ATP marcato con 32P • Usata come sonda in saggi di overlay • PULL DOWN ASSAY • MPK6-Hisx6 è stata: • incubata con una resina contenente glutatione-sefarosio-4B su cui era stata immobilizzata la GST-14-3-3 • Eluita con glutatione • Analizzata in western blotting

More Related