Biokeemiline katalüüs ja metabolism

1. Biokeemiline katalüüs ja metabolism 30.08.2005

2. Loengukursus Biokeemia II   • Toimumisaeg: 30. august -3. oktoober 2005 • Biokeemiline katalüüs ja metabolism • Biokeemiline termodünaamika ja metabolism •  BLOKK: süsivesikute metabolism • Glükolüüs • Pentoosfosfaadi rada • Tsitraaditsükkel • Glükoneogenees • Glükogeeni metabolism. Süsivesikud toitainetena • Fotosünteetiline süsivesikute süntees •  BLOKK: ATP süntees • Mitokondriaalne hingamisahel • ATP süntees eluslooduses •  BLOKK: lipiidide metabolism • Lipiidide katabolism • Lipiidide biosünteesist •  BLOKK: Lämmastikku sisaldavate ühendite metabolism • Lämmastiku fikseerimine. Aminohapete biosüntees • Aminohapete süsiniku katabolism • Aminohapete lämmastiku katabolism. Uurea tsükkel • Püriinide ja pürimidiinide metabolism •  BLOKK: metabolismi integratsioon • Keemilised reaktsioonid metabolismis • Kofaktorid ja vitamiinid • Metabolismi integratsioon imetaja organismis I • Metabolismi integratsioon imetaja organismis II

3. Ensüümid- biokatalüsaatorid • Praktiliselt kõik metabolismi reaktsioonid on ensümaatilised • Kiirendavad reaktsioone sageli 106 to 1012 korda • Ensüümid ei muuda reaktsioonideDG • Ensümaatilised reaktsioonid kulgevad pehmetes tingimustes • Ensümaatilised reaktsioonid on spetsiifilised • Ensümaatilised reaktsioonid on sageli reguleeritavad

4. Substraadispetsiifilisus • Substraadi spetsiifilisus taandub eelkõige spetsiifililisele kompleksi moodustamisele mittekovalentsete jõudude abil • Van der Waals jõud • Elektrostaatilised jõud (ioonsed sidemed) • Vesinikside • Hüdrofoobne interaktsioon

5. Ensüümide stereospetsiifika O Pärmi alkoholi dehüdrogenaas

6. NAD+ CH3CD2OH + Ox. O + CH3C-D Red. Reaktsioonis eemaldataksePro-R vesinik NADD Pärmi alkoholi dehüdrogenaas

7. O 2. NADD + CH3-C-H O 3. CH3-C-D + NADH Juhul kui kasutada erinevat enantiomeeri, ei toimuDülekannet YADH onPro-R stereospetsiifiline

8. Ensüümide geomeetriline spetsiifika Sarnase struktuuriga homoloogilise rea ühendid on sageli ühe ja sama ensüümi substraadiks Vastavad ühendid võivad erineda teatud asendaja või isegi keemilise sideme osas

9. Ensüümreaktsioonide kineetika Ensümaatilised reaktsioonid on nulljärku kui substraadi kontsentratsioon on kõrge. Nulljärku tähendab, et reaktsiooni kiirus ei kasva substraadi kontsentratsiooni kasvades. Sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon glükoosiks ja fruktoosiks sahharoos + H2Oglükoos + fruktoos invertaas

10. E = Ensüüm S = Substraat P = Produkt ES = Ensüüm-Substraat kompleks k1pärisuunalise reaktsiooni kiiruskonstant k-1 = ES substraadiks tagasi lagunemise reaktsiooni kiiruskonstant k2 = produktide moodustamise reaktsiooni kiiruskonstant

11. Kui substraadi kontsentratsioon on piisavalt kõrge, on kogu ensüüm seotud ES kujul kompleksi. Reaktsiooni teine etapp saab kiirust limiteerivaks, sest rohkem ES moodustuda ei saa ehk ES kontsentratsioon on maksimaalne. [ES] hulk on määratud tema moodustumise ja lagunemise kiiruste vahega. 1

12. Eeldus I- tasakaalulisuse eeldus k-1>>k2ehk produkti moodustumise kiirus on palju aeglasem ES kompleksi tekke kiirusest Sellel juhul kehtib järgmine võrrand: Kson ES kompleksi dissotsiatsioonikonstant

13. Eeldus II- statsionaarse oleku eeldus Reaktsiooni vaadeldakse kulgevana tingimustes, kus ES kontsentratsioon ei muutu 2

14. 3 kombineerides 1 + 2 + 3 Korraldades ümber Jagame k1läbi ja avaldame [ES] Selles võrrandis

15. voon siin reaktsiooni algkiirus st tingimustes kus reaktsioon on just alanud. reaktsiooni maksimaalne kiirus Michaelis - Mentenivõrrand

16. Kmvastab substraadi kontsentratsioonile, kus voon pool Vmaxväärtusest

17. Topelt pöördteljestikus graafik

18. KMja kcat omavad varieeruvaid väärtusi erinevate ensüümide ja substraatide korral The KM on väljendatav kui: Kui Ks väheneb, suureneb ensüümi afiinsus substraadi suhtes. Seega on KM substraadi afiinsuse mõõduks tingimustel kui k2<k-1

19. Michaelis -Menteni kineetika korral k2= kcat Kui [S] << KMmoodustub väga vähe ES ja [E] = [E]T Nendes tingimustes: kcat/KMon katalüütilise efektiivsuse mõõt

20. Täiuslik ensüüm katalüüsi aspektist? Kui k2>>k-1või suhe on maksimaalne Iga substraadi molekul, mis seondub ensüümiga konverteeritakse produktiks- see on katalüütiline perfektsus Siis Diffusiooni poolt kontrollitud piir- substraadi diffusioonikiirus on suurusjärgus 108 to 109 M-1s-1. Ensüüm alandab üleminekuoleku energeetilist barjääri nii, et katalüüsi kiirus on määratud ära substraadi ja ensüümi molekulide kokkupõrke kiirusega.

21. Ensümaatilise aktiivsuse regulatsioon 2 meetodit ensüümi aktiivsuse kontrolliks 1. Kontrolli olemasoleva ensüümi hulka 2. Kontrolli ensüümi katalüütilist aktiivsust. Ensüümi hulk rakus sõltub sünteesi kiirusest ja degradatsiooni kiirusest Ensüümi süntees kontrollitakse transkriptsiooni ja translatsiooni tasemel Degradatsioon on samuti reguleeritud (avaldub ensüümide poolestusaja erinevuses) Ensüümaatilise aktiivsuse regulatsioon on eelmistest kiirem

22. Ensüümi katalüütilise aktiivsuse muutmiseks võib: -muuta ensüümi molekuli konformatsiooni -teha kovalentseid modifikatsioone Ensüümi aktiivsust võidakse reguleerida kas aktiveerides või inhibeerides. Spetsiifiliselt saab väikeste efektormolekulidega mõjutada ka ainult katalüütilist saiti. Kovalentne modifikatsioon: -aktivatsioon spetsiifilise proteolüüsiga -valkude fosforüülimine Ser (Thr, Tyr) jääkidel. Sageli hormonaalselt kontrollitud ja toimub korraga paljudes kudedes

23. Aspartaadi Transkarbamoülaas: Pürimidiinide biosünteesi esimene etapp. ATCaas H2PO4- + + Karbamoüül Aspartaat N-Karbamoüül aspartaat fosfaat ATCaas on kontrollitud allosteeriliselt metaboolse raja lõppprodukti poolt - tagasiside

24. NB! Pane tähele kõverate S kuju! Positiivne homotroofne effekt Heterotroofne inhibeerimine CTP poolt Heterotroofne aktiveerimine ATP poolt

25. Inhibeerimine tagasiside kaudu Metaboolse raja produkt inhibeerib iseenese sünteesi mõjutades raja esimest unikaalset (commited) reaktsiooni

26. CTP on raja produkt ja DNA ning RNA sünteesi prekursor. Kiire nukleiinhappe sünteesi korral väheneb CTP hulk rakus ja ATCaasi aktiivsus suureneb. Kui ATCaasi aktiivsus on suurem kui vaja st CTP hakkab akumuleeruma, seondub CTP ensüümiga ja inhibeerib aktiivsuse. ATP aktiveerib ATCaasi. Puriine ja pürimidiine on vaja RNA ja DNA sünteesis ligikaudu samas hulgas. Kui ATP kontsentratsioon on kõrgem kui CTP kontsentratsioon, seondub ATP ATCaasiga ja aktiveerib viimase seniks kuni CTP kontsentratsioon samuti tõuseb.

28. Ensüümreaktsioonide inhibiitorid Inhibiitorid jaotatakse -pöörduvad (konkurentsed, mittekonkurentsed, ebakonkurents. -pöördumatud

29. Pöörduvad inhibiitorid jaotatakse omakorda: konkurentsed mittekonkurentsed ebakonkurentsed Konkurentne inhibiitor- sarnaneb normaalsele substraadile ja konkureerib sellega samasse tsentrisse sidumise pärast Mittekonkurentne inhibiitor- seonduvad mitte aktiivtsentrisse vaid kuhugi mujale, aga mõjutavad sellega ensümaatilist aktiivsust Ebakonkurentne inhibiitor- sarnanevad mittekonkurentse inhibiitoriga, ent seonduvad ainult ES kompleksiga. substraat substraat substraat Konkurentne inhibiitor mittekonkurentne inhibiitor ensüüm ensüüm ebakonkurentne inhibiitor ensüüm

30. Ensüümreaktsioonide inhibiitoritest II Konkurentne inhibiitor- konkureerib substraadiga ensüümile sidumises Mõju avaldub aktiivse substraadi seondumises osaleva ensüümi kontsentratsiooni alanemises; vmax jääb samaks, Km suureneb Km*=aKm a=1+[I]/Ki

31. Ensüümreaktsioonide inhibiitorid IV Ebakonkurentne inhibiitor, seondub ES kompleksiga, ei seondu vaba ensüümiga. Seega ei sega ES kompleksi moodustumist vaid ainult katalüüsi. Harvaesinev, multisubstraatse katalüüsi korral.

32. Müoglobiini ja hemoglobiini struktuur Andrew Kendrew ja Max Perutz 1959 kuni 1968. Struktuuri analüüs on võimaldanud küsida fundamentaalseid küsimusi. Kuidas seondub hapnik, kuidas realiseerub kooperatiivne sidumine, millised on punktmutatsioonide efektid struktuurile ja funktsioonile. Müoglobiin: 44 x 44 x 25 Å üks subühik 153 aminohappe jääki 121 jääki kuulub heeliksite koosseisu. Heeliksid A, B, C, …F. Heemi tasku moodustavad E ja F. Ka heeliks H asub heemi lähedal.

33. Hemoglobiin ja müoglobiin • Veri on punane... • Esimene kristalliseeritud valk - 1849. • Esimene valgu korrektne molekulmass. • Esimene röntgenstruktuuranalüüs. • Esimene ultratsentrifuugiga uuritud valk. • Esimene valk, mille funktsioon osutus füsioloogias oluliseks. • Esimene funktsiooni omav punktmutatsioon. • Koperatiivse seondumise ja allosteeria fenomenid esimest korda analüüsitud

34. Müoglobiini ruumiline struktuur

36. Heemi kompleks müoglobiiniga

37. Hemoglobiin 4 subühikuline valk, molekul 64 x 55 x 50 Å sümmeetrilinea and b subühikud on sarnasedD heeliks puudub hemoglobiini aahelas. Erinevate subühikute vahel moodustuvad ulatuslikud kontaktida2-b2 võia1-b1 piirpinnal 35 jääki, a1-b2 and a2-b1 19 jääki, mis on kontaktis. Hapniku sidumine hemoglobiini molekuliga toob kaasa olulised struktuursed muutused

38. Deoksü- ja oksühemoglobiini kvaternaarne struktuur R-olek T-olek

39. Oksügeenimine pööraba1b1 dimeeria2b2 dimeerisuhtes umbes 15° Deoksü oleku konformatsiooni nimetatakse Tolekuks Oksü olekukonformatsiooni nimetatakseRolekuks Mis põhjustab R ja T oleku erineva konformatsiooni? Kuidas on see seotud hapniku sidumisega?

40. O2sidumise positiivne kooperatiivsus Hb molekuliga tekib sellest, et ligandi seondumine ühe heemiga mõjutab konformatsiooniliste muutuste kaudu ligandi sidumise afiinsust teiste heemidega. Fe ioon paiknebdeoksü oleku korral 0.6 Å eemal heemi tasapinnast. Hapniku sidumine viib raua tagasi heemi tasapinda.Proksimaalne His F8 on seotud Fe iooniga ja tõmbab endaga kaasa kogu F heeliksi.

43. Esimese hapniku molekuli sidumine Hb heemiga on raskem, kuid sellega kaasneb a1-b2 kontaktide muutus ja distaalsete His E7 and Val E11 eemaldumine sellest kohast, kuhu hapnik seondub teistes subühikutes Fe iooniga. Sellega kaasneb hapniku afiinsuse kasv heemi suhtes- positiivne kooperatiivsus. a1-b2 kontaktidel on 2 stabiilset positsiooni. Vastavad kontaktid on stabiliseeritud 2 erineva vesiniksidemete komplektiga- binaarne ümberlüliti T ja R oleku vahel.

45. T R üleminek saavutatakse Fe-O2sideme moodustumise energia arvel. • Hemoglobiini O2 –sidumise kooperatiivsus tuleneb T  R konformatsiooni muutusest. • Fe aatom ei saa paikneda heemi tasapinda ilma et toimuks proksimaalse His asukoha muutus, mis vastasel korral põrkuks porfüriini tsükliga • Proksimaalne His on väga tihedalt ümbritsetud naabruses asetsevate aatomite poolt ja ei saa reorienteeruda ilma terve F heeliksi liikumiseta. • F heeliksi liikumine on ainult võimalik kui üheaegselt toimub muutus kvaternaarse struktuuri tasemal, mille käigus a1C-b2FG kontakt liigub ühe sammu võrra pikia1C heeliksit.

46. a1-b1 jaa2-b2 piirpindade jäikuse tõttu on see nihe võimalik ainult nii, et korraga toimuvad muutused nii a1-b2 kui ka a2-b1 piirpinnal. Tulemusena ei saa üks subühik eraldi konformatsiooni muuta. KAS ÜKS VÕI MITTE ÜKSKI Ühe subühiku t olek, millel on madalam afiinsus hapniku suhtes transformeerub r olekuks ilma hapnikku sidumata kui mõni teine subühik seob hapniku molekuli. Sellised r olekus subühikul on hapniku suhtes kõrgem afiinsus.

48. T ja R oleku hapniku sidumise kõver annab summana eksperimendis täheldatava S kujulise sõltuvuse

49. Hemoglobiini funktsioon • a2,b2dimeer, sarnased müoglobiinile • Transpordib hapnikku kopsudest kudedesse. • O2difusioon on liiga ebaefektiivne suurte loomade jaoks. • O2lahustuvus on plasmas madal, i.e. 10-4 M. • Seotuna hemoglobiinile on [O2] = 0.01 M, ehk sama mis õhus • Alternatiivsed O2 transporterid; • Hemotsüaniin, Cu sisaldav valk. • Hemerütriin, heemi mittesisaldav valk.

50. Müoglobiin vahendab hapnikku lihaskoes O2 diffusioonikiirus kapillaaridest kudedesse on aeglane Müoglobiin kiirendab difusiooni sidudes hapniku. Hapnikuvarude salvestamine?