Molekuláris genetika dr. Fekete Sándor

1. Molekuláris genetikadr. Fekete Sándor

2. I. részAz örökítő anyag felfedezése

3. Tartalomjegyzék • 1. Az örökítő anyag felfedezése (általános áttekintés) • 2. Gregor Mendel • 3. Carl Correns és Hugo de Vries • 4. Walter S. Sutton és Theodor Bovery • 5. T.H. Morgan • 6. Hogyan határoz meg egy gén egy tulajdonságot? • 6.1 Archibald Gerrod • 6.2 Beadle és Tatum • 7. A fehérje vagy a DNS az örökítő anyag? • 7.1 Griffith • 7.2 O. Avery, C. McLeod, M. McCarty • 7.3 Hershey és Chase • 8. Milyen a DNS térszerkezete? • 8.1 A DNS szerkezete a kémiai vizsgálatok alapján • 8.2 A DNS szerkezete a röntgendiffrakciós elemzés alapján • 8.3 A DNS szerkezete a modell építés alapján

4. Az DNS molekula pontos térszerkezetét Watson és Crick 1953-ban fedezte fel. Az idáig vezető hosszú úton az örökítő anyag anyagi természetével, tulajdonságaival és hatásmechanizmusával kapcsolatos ismereteink lépésről lépésre, fokozatosan gyarapodtak. Ennek az útnak a legfontosabb mérföldköveinél állunk most meg és ismerkedünk meg azokkal a legfontosabb felfedezésekkel, melyek alapvetően alakították elképzelésünket az örökítő anyagról és így nagyban hozzájárultak annak végső tisztázásához: Az örökítő anyag felfedezése (bevezetés)

5. 1. Az örökítő anyag felfedezése (általános áttekintés) • Az örökítő anyag felfedezéséhez vezető út tudománytörténeti szempontból legmeghatározóbb kutató egyéniségeit és tudományos munkájuk eredményeit, azok jelentőségét a következő lépésekben követjük nyomon: • Gregor Mendel borsó növénnyel végzett keresztezési kísérletei alapján arra a következtetésre jut, hogy a tulajdonságok meghatározott anyagi részecskékhez kötve öröklődnek, melyeket ő faktornak nevezett. Az elmélet a részecske/faktoriális öröklődés (particulate inheritance) néven vált ismertté. • Carl Correns és Hugo de Vries megismétlik Mendel kísérleteit. Mendel munkájának újrafelfedezése. • Walter S. Sutton és Theodor Bovery felfedezi, hogy Mendel faktorai a kromoszómákon elhelyezkedő gének és ezzel megteremti az öröklődés kromoszóma elméletét. • T.H. Morgan munkássága egyértelművé teszi, hogy a gének a kromoszómákon helyezkednek el egymás után.

6. Az örökítő anyag felfedezése (bevezetés) • A következőkben a tudományos munka három alapvető kérdés megválaszolására irányult: • Hogyan határoz meg egy gén egy tulajdonságot? • Archibald Gerrod az alkaptonúria betegség tanulmányozása kapcsán veti felaz egy gén – egy enzim elképzelést. • Beadle és TatumNeurospora crassa-n végzett átfogó kísérletei alapján tudományos megerősítést nyer az egy gén – egy enzim teória. Az elmélet szerint a gének enzimeket hoznak létre, melyek az egyes anyagcsereutak reakcióit katalizálják. • 2. A fehérje vagy a DNS az örökítő anyag? • Griffith felfedezi a genetikai transzformáció jelenségét. A kísérlet a DNS szerepére utal az örökletes anyag átvitele kapcsán. • O. Avery, C. McLeod, M. McCarty kísérletsorozatában enzimatikusan emészti a fő makromolekulákat és csak akkor nem tapasztal transzformációt, ha a DNS-t is megemészti. • Hershey és Chase elegáns kísérletben bizonyítják, hogy a bakteriofág a DNS-ét juttatja a baktériumsejtbe a fertőzés során; tehát a DNS az örökítő anyag. • 3. Milyen a DNS térszerkezete? • A DNS szerkezete a kémiai vizsgálatok alapján. • A DNS szerkezete a röntgendiffrakciós elemzés alapján.Rosalind Franklin és Maurice Wilkins munkássága. • A DNS szerkezete a modell építés alapján.Watson és Crick felfedezik a DNS kettősspirál térszerkezetét.

7. 2. Gregor Mendel Fenotípus: lila fehér Genotípus: AA aa Gaméták: P a A F1 Fenotípus: minden virág lila Genotípus: Aa Gaméták: A a F2 a A A AA Aa a Aa aa 3 : 1 Mendel elmélete szerint a tulajdonságok öröklődéséért meghatározott anyagi részecskék ún. faktorok felelősek, melyek nem olvadnak össze, megtartják elkülönült jellegüket. Az elmélet az anyagi részecskéhez kötött öröklődés (particulate inheritance) néven vált ismertté. • Mendel egyik kísérletében a veteményborsó (Pisum sativum) virágszínének öröklődését vizsgálta. • Tiszta származéksorból származó lila virágú és fehér virágú egyedeket keresztezett. • Eredmények: • Az F1 nemzedék valamennyi egyede lila virágot hozott. A lila tehát domináns a recesszív fehérrel szemben. • Az F1 nemzedék egyedei között végrehajtott további keresztezés az F2 nemzedékben körülbelül háromszor annyi lila utódot hozott, mint fehéret.

8. Fenotípus: lila fehér Genotípus: AA aa Gaméták: P a A F1 Fenotípus: minden virág lila Genotípus: Aa Gaméták: A a F2 a A A AA Aa a Aa aa 3 : 1 Mendel a keresztezés eredményeinek értelmezésére a következő elméletet dolgozta ki: • Az egyedekben mindig egy faktorpár határoz meg egy tulajdonságot, de megtartják diszkrét, elkülönült jellegüket. Mai értelmezés: a szülői nemzedék tagjai a lila és fehér színekre homozigóták tehát azonos allélt/génváltozatot hordoznak az adott jellegre (AA, aa). Mendel faktorai megfelelnek az alléloknak. • Az ivarsejtekbe minden faktorpárból csak az egyik kerül változatlan formában, tehát az ivarsejtek vagy az egyik vagy a másik faktort hordozzák.(gaméták tisztaságának a törvénye). Mai értelmezés: az ivarsejtképzés során (meiótikus sejtosztódás során), az allélpárok szétválnak és minden haploid ivarsejtben az allélpárból már csak egy van jelen. • Megtermékenyítéskor a hím és női ivarsejtek véletlen találkozásakor az új egyedekben ismét két faktor határoz meg egy tulajdonságot. • A diploid zigótában a két allél ismét párban található. • Mendel borsókísérleteinek eredményeit forradalmian új módon értelmezte és ezzel megalkotta a genetika mai napig érvényes szabályait. • . E szerint az elv szerint tehát a tulajdonságot meghatározott anyagi részecskék hordozzák. Ezek a részecskék megtartják diszkrét elkülönült jellegüket az egyedekben (hibridekben is), és változatlan formában válnak szét és adódnak tovább az ivarsejtekbe, melyeken keresztül szintén változatlan formában kerülnek az új zigótába. Az elmélet mindezek alapján a részecske öröklődés /particulate inheritance néven vált ismertté (legalábbis az angol nyelvű szakirodalomban)

9. Mendel munkássága messze megelőzte korát… • Mendel zsenialitását akkor tudjuk igazán értékelni, ha nem felejtjük el, hogy Mendel korának általánosan elfogadott nézete szerint a tulajdonságok az egyedekben összeolvadnak, mint ahogy kétféle festék összeolvad. • Mendel nagysága másrészt abban rejlik, hogy az öröklődés máig érvényes törvényszerűségeitúgy ismerte fel, hogy a kor természettudósai közül még senki semmit nem tudott kromoszómákról, nem beszélve azok kémiai felépítéséről. • Mendel ezzel az elméletével megjósolta nemcsak a kromoszómák létezését, hanem azoknaka meiózisban mutatott viselkedését is. • Mendel eredményeit korának tudományos közvéleménye nem értékelte, nem tudta értelmezni, annak ellenére, hogy Darwin kortársa volt.

10. 3. Carl Correns és Hugo de Vries Carl Correns, német botanikus és Hugo de Vries, holland botanikusnevéhez fűződnek azok a kísérletek, melyekkel tulajdonképpen újra felfedezték a már Mendel által lefektetett szabályokat. Az 1900-as évek legelején Carl Correns német botanikus és Hugo de Vries holland botanikus egymástól függetlenül végezték keresztezési kísérleteiket és ugyanazokat az eredményeket kapták, mint Mendel. Egyik kutató sem ismerte Mendel munkáját korábban, de mindketten elismerték Mendel elsőbbségét a témában. Ezzel megtörtént Mendel munkásságának felfedezése és (sajnos már csak poszt humusz) elismerése is. Carl Correns Hugo de Vries

11. A XX. Század első évtizedében a sejttani ismeretek gyarapodása, Mendel törvényeinek újra felfedezése és a csíraplazma elmélet mind abba az irányba mutat, hogy a sejtmagban található kromoszómák az öröklődésben kulcsszerepet játszanak. • Oskar Hervig (1849-1922), leírja a megtermékenyítés és a zigóta kialakulásának folyamatát. • Walter Flemming (1843-1905) leírja az általa „mitózisnak” nevezett sejtosztódás során a kromoszómák viselkedését. • August Weismann (1843-1914) megalkotja a csíraplazma egymást követő nemzedékeken keresztüli folytonosságáról szóló elméletét. • Wilhelm Johannsen (1857-1927), holland botanikus megalkotja a „gén” kifejezést.

12. 4. Walter S. Sutton és Theodor Boveri • Theodor Boveri (1862-1915) és Walter S. Sutton a meiózis folyamatát pontosan leírják és egymástól függetlenül arra a következtetésre jutnak, hogy a gének (a mendeli faktorok) a kromoszómán helyezkednek el és ezzel megalkotják az öröklődés kromoszómaelméletét: Következtetéseiket a következő megfigyeléseik alapján vonták le: Az egyed sejtjeiben minden kromoszóma párban található és a két homológ kromoszóma azonos helyein (lókuszain) található két allél határoz meg egy tulajdonságot. Mendel szerint az egyedben minden tulajdonságot két faktor határoz meg. Meiózis során a kromoszómapárok ugyanúgy válnak szét és kerülnek külön ivarsejtbe, mint a mendeli szabályok szerint a faktorpárok, ill. mai szóhasználattal: allélpárok. Az ivarsejtek mindig a kromoszómapárok egyikét tartalmazzák, tehát megtermékenyítéskor a zigóta a kromoszómapár egyikét az apától a másikat az anyától kapja. Mendel elmélete szerint ugyanez igaz a faktorokra. Mendel dihibrid kísérleteiben fogalmazta meg a két tulajdonság független öröklődését, aminek a két kromoszómapár (két homológ pár) meiózisban történő egymástól független szétválása az alapja.

13. 5. Thomas Morgan Thomas Morgan (1866-1945) géntérképezési és keresztezési kísérletei további bizonyítékokat szolgáltattak az öröklődés kromoszóma elmélete mellett. Az öröklődés kromoszóma elméletét támasztották alá ezen kívül Thomas Morgannak azok a genetikai kísérletei, melyekben egy adott tulajdonság egy konkrét kromoszómához köthető. Ilyen például az ivarhoz kötött öröklődés, amikor az ecetmuslica fehér (mutáns) szemszíne az X ivari kromoszómához kötött módon öröklődik. Morgan géntérképezési eredményei is teljesen egyértelművé tették, hogy a gének a kromoszómák meghatározott helyein/lókuszain és egymástól meghatározott távolságra helyezkednek el. Összegzésképpen megállapíthatjuk, hogy Mendel teljesen elméleti alapon kidolgozott faktor elméletének a citológusok megtalálták az anyagi hordozóját a kromoszómák formájában.

14. A következő évtizedekben a kutatók figyelme alapvetően három fontos kérdés megválaszolására irányult: • Hogyan határoz meg egy gén egy tulajdonságot? • A fehérje vagy a DNS az örökítő anyag? • Mi a molekuláris szerkezete az örökítő anyagnak?

15. 6. Hogyan határoz meg egy gén egy tulajdonságot?

16. 6.1 Archibald Gerrod Sir Archibald Gerrodzseniálisan meglátta a kapcsolatot az alkaptonúria esetében az enzim hiánya és a betegség örökletes jellege között. Ha az enzimhiányt örökölni lehet, akkor a gén egy enzim termeléséért felelős. • A kérdésre, hogy egy gén hogyan fejti ki hatását, az első hipotézist már 1909-ben Sir Archibald Gerrod szolgáltatta, aki alkaptonúriás betegeket vizsgált. Az alkaptonúria egy örökletes betegség, amelyben a beteg vizelete egy homogentizinsav nevű vegyületet tartalmaz, amely megfeketedik a levegőn (oxidálódik). • Gerrod érvelése szerint a betegeknek örökletesen hiányzik az az enzimük, amely a homogentizinsav lebontásáért lenne felelős. • A betegség öröklésmenetéből Gerrod arra következtetett, hogy a rendellenességet egyetlen gén recesszív mutációja okozza, amely akkor jelenik meg, ha a két hibás allél homozigóta állapotba kerül. • A betegekben tehát a hibás gén miatt nem termelődik az enzim, amely a homogentizinsav lebontásáért felelős. Gerrod hipotézisének tudományos jelentősége abban áll, hogy elsőként mondta ki, a gén egy enzimet határoz meg, amely részt vesz valamilyen anyagcsere folyamatban. Az egy gén – egy enzim elv.

17. 6.2 Beadle és Tatum Beadle és Tatum a röntgensugárzás DNS-károsító hatását (mutagén hatását) felhasználva enzimhiányos Neurospora crassa mutánsokat hozott létre és ezzel kísérletes bizonyítékát szolgáltatták annak a teóriának, miszerint a gének enzimek termelésén keresztül fejtik ki hatásukat. Beadle és Tatum a Neurospora crassa-val végzett kísérletsorozata A legegyértelműbb bízonyítékot a gén és az enzim kapcsolatának tisztázására George Beadle és Edward Tatum kísérletei szolgáltatták. A kísérlet célja: A gén és enzim közötti kapcsolat feltárása. Hipotézis: Ha valóban létezik direkt kapcsolat a gének és az enzimek között (vagyis a gének enzimeket határoznak meg), akkor a röntgensugárzás mutagén hatását felhasználva előállítható olyan mutáció, amely a specifikus enzimreakció katalizálására képtelen, hibás fehérjét eredményez. A következő diák segítségével kövessük nyomon a kísérlet egyes lépéseit, melyeket Beadle és Tatumhipotézisük tesztelésére dolgozott ki. Első lépés: Röntgennel indukált mutánsok között arginin auxotróf mutánsok azonosítása. Második lépés: Az arginin auxotróf mutánsok további jellemzése aszerint, hogy az argininhez vezető anyagcsereút három enzime közül melyik nem termelődik a mutáns gén miatt. A mutáns vonalak meghatározása a mutációt hordozó gének szerint (1 2 3 mutáns vonal).

18. A Neurospora crassa ideális modellszervezet: • A kísérlet sikerének mindig feltétele egy alkalmas modellszervezet kiválasztása, amely jelen esetben a tömlősgombák közé tartozó közönséges kenyérpenész, a Neurospora crassa volt. • A faj életciklusának nagy részében haploid, így a fenotípus alapján közvetlen következtethetünk a genotípusára. • A N. crassakönnyen és gyorsan tenyészthetőlaboratóriumi körülmények között, ahogy az az ábrán követhető. Reprodukciós ciklusa mindössze 10 nap. • A vad típusú Neurospora törzsek olyan minimál táptalajon is képesek nőni, amely nintrogénforráskéntammónium-kloridot, valamint szerves szén- és energiaforrásként glükózt tartalmaz néhány szervetlen ion és biotin mint vitamin mellett. A vad típusú gomba rendelkezik a teljes enzimkészlettel ahhoz, hogy ezekből az egyszerű nitrogén- és szénforrásokból minden fontos szerves molekuláját (aminosavakat, purin és pirimidin bázisokat) fel tudja építeni. • Léteznek olyan mutánsok, melyek nem képesek egy bizonyos aminosavat vagy vitamint szintetizálni maguknak és növekedésükhöz ezeket a vegyületeket a táptalajukban készen kell biztosítani számukra. Az ilyen mutánsokat auxotróf mutánsoknakhívják (szemben a normál prototróf típussal) és ezek már csak az ún. teljes táptalajon tudtak növekedni a minimál táptalajon már nem. A teljes táptalaj minden szerves molekulát (aminosavakat, purin és pirimidin bázisokat stb.) tartalmaz. • A mutánsok azonosítása az alapján, hogy tud-e minimál táptalajon nőni vagy nem nagyon egyszerű. 1. Két vonal keresztezése úgy történik, hogy az ellentétes szaporodási típusú (haploid) hifákat egy kultúrában tenyésztik. 2. A két típusú hifa egy-egy sejtje összeolvad és egy magpáros (dikarionos) sejtet hoz létre, ahol a két sejtmag egyesül (ez a rövid diploid állapot). 4. Ezeket a haploid spórákat lehet leoltani táptalajra és ezekből haploid hifák fejlődnek. A hifák ivartalanul képzett szaporító képletei a konídiumok. Reprodukciós ciklusa mindössze tíz nap. 3. A diploid sejt meiótikusan osztódva 8 haploid spórát/aszkospórát termel a tömlőkben/aszkuszokban.

19. Első lépés : Röntgennel indukált mutánsok között arginin auxotróf vonalak azonosítása 1. A vad típusú konídiumokban röntgensugárzással indukáltak mutációkat. (A röntgensugárzás a DNS-t roncsolja.) 2. A besugárzott konídiumokat vad típussal keresztezték, melyek a képen látható tömlők mindegyikében meótikusan 8 haploid spórát termelnek. 3. A spórákat egyenként a kémcsövekben teljes táptalajra oltották, ahol mindegyik növekedett. 4. Minden egyes kémcsőből egyenként oltották át az egyes vonalakat a teljes táptalajról a minimál táptalajra. 5. A minimál táptalajon nem növekvő auxotróf mutáns vonalból egy olyan minimál alapú táptalajsorozatra oltották át a konídiumokat, melyeknek minden tagja/kémcsöve a 20 aminosavnak csak egyikét tartalmazta. 6. Amennyiben az auxotróf vonal csak az arginin aminosavval kiegészített táptalajon volt képes növekedni, az azt jelenti, hogy arginint nem tud szintetizálni, tehát arginin auxotróf.

20. Első lépés : Röntgennel indukált mutánsok között arginin auxotróf vonalak azonosítása A mutáns egyedek keresztezési kísérleteiből kiderült, hogy a hibás jelleg (mint tulajdonság) egyszerű egygénes öröklődésű, amely a mendeli szabályoknak megfelel. Az eredmények alapján levont következtetés: Bizonyítást nyert tehát, hogy röntgensugárzással létrehozható olyan mutáció (az örökítő anyag változása), amely hibás enzim termelését eredményezi. A mutáns gén okozza tehát az enzim hibás működését. Az egy gén – egy enzim hipotézis kétséget kizáróan megerősítést nyert.

21. Második lépés: Az arginin auxotóf mutánsok további jellemzése A keresztezési és géntérképezési kísérletek alapján bebizonyosodott, hogy az arginin auxotróf mutánsok nem egyformák, hanem három mutációs csoportba sorolhatók aszerint, hogy az azonosított három gén közül melyikben történt a mutáció. Biokémiai kutatásokból már ismertek voltak az arginin bioszintézis út feltételezett intermedier vegyületei: prekurzor, ornitin citrulin. A kísérlet célja: Bebizonyítani, hogy az arginin bioszintézis út minden lépését egy külön enzim katalizálja, amelynek mindegyikéhez egy gén rendelhető. A kísérlet hipotézise: A három mutáns vonal ezek alapján a bioszintézis út más-más pontján akad el, aszerint, hogy melyik enzim génje mutáns (illetve melyik enzim hibás). A mutáns vonalak így hozzárendelhetők azokhoz az intermedier molekulákhoz, melyeket az egyes enzimek hiánya miatt a mutáns vonalak nem tudnak termelni, tehát készen igénylik azokat (az intermedier molekulákat)a táptalajban. Az ábrán látható kísérleti elrendezésben az egyes (1. 2. 3.) mutáns vonalakat hozzá tudták rendelni azokhoz az intermedier molekulákhoz, melyek hozzáadásával (a minimál táptalajhoz) már tudtak nőni, ami azt jelenti, hogy képesek voltak arginint szintetizálni. Ebből arra következtettek, hogy a mutáns gén mindig azt a lépést nem tudja katalizálni, melynek reakciótermékét igényli a táptalajban, mivel maga nem tudja előállítani. A mutáns vonalak ill. gének hozzárendelése az egyes intermedierekhez lehetővé teszi, hogy a bioszintetikus út köztes termékeit sorrendbe állítsuk és ezzel az egész bioszintetikus út egyes lépéseit és az ezeket katalizáló enzimeket rekonstruáljuk.

22. A minimál táptalajhoz adott feltételezett intermedierek A vad típus mindegyik táptalajon nő, mert a prekurzor molekulából képes arginint szintetizálni. Az 1 mutáns vonal csak arginin jelenlétében nő, ami azt jelenti, hogy rossz az a génje/enzimje,(C gén) amelyik vagy a citrulint vagy az ornitint argininné alakítja. x A 2 mutáns vonal ornitin jelenlétében még nem, de citrulin jelenlétében már képes fejlődni, ami az jelenti, hogy citrulinból képes arginint szintetizálni (ornitinből viszont nem). x x A 3 mutáns vonal a minimál táptalajon még nem, de ornitin jelenlétében már képes növekedni, ami azt jelenti, hogy a prekurzor molekulából nem tud ornitint szintetizálni. Ornitinből viszont már képes arginint előállítani. A 3. vonalban az ‘A’ gén mutáns. Itt szakad meg a folyamat. A 2. vonalban a ‘B’ gén mutáns. Itt szakad meg a szintézis út. Az 1. vonalban a ‘C’ gén mutáns. Itt szakad meg a szintézisút.

23. Követekeztetés: A bioszintetikus út minden egyes lépését egy arra specifikus enzim katalizálja, melynek mindegyikét egy külön gén határoz meg. Az egy gén – egy enzim teória teljes bizonyítást nyert!

24. Egy gén – egy fehérje elmélet Az enzimek mellett még nagyon sokféle funkciót ellátó fehérje fordul elő a szervezetben. Kollagén, keratin, aktin miozin, hemoglobin hormonok Hamar nyilvánvalóvá vált, hogy ezeket a fehérjéket is mind gének határozzák meg, így az egy gén – egy enzim teóriáját kicsit pontosítani kellett. egy gén – egy fehérje

25. Egy gén – egy polipeptid elmélet A hemoglobin négy alegységből áll: két azonos alfa és két azonos béta alegységből. A két alegység polipeptidjét két, külön kromoszómán található gén kódolja. Ennek megfelelően Beadle és Tatum eredeti egy gén – egy enzim teóriáján ismét változtatni kellett: egy gén – egy polipeptid

26. 7. A fehérje vagy a DNS az örökítő anyag Fehérje? DNS?

27. A fehérje vagy a DNS az örökítő anyag • Milyen feltételeknek kell eleget tennie az örökítő anyagnak? • Az örökítő anyagnak mindenképpen képesnek kell lennie arra, hogy megduplázódjon és hű másolatot tudjon magáról készíteni. • Nagy mennyiségű információt kell tudnia tárolni. • az örökítő anyagnak nagyon stabilnak és ellenálló szerkezetűnek kell lennie, hogy a genetikai program ne változzon, ne vesszen el belőle semmi. • A nagyfokú stabilitás mellett azonban a kismértékű változás lehetőségét is hordoznia kell az örökítő anyagnak. Ennek hiányában a gének nem tudnának mutálódni, nem alakulnának ki új allélok, ami a genetikai sokféleség alapja.

28. A FEHÉRJE ESÉLYESEBB JELÖLT VOLT MINT A DNS… • A múlt század első felében az általános tudományos vélekedésszerinta fehérje sokkal alkalmasabbnak tűnt az örökítő anyag szerepének betöltésére, mint a DNS. • A DNS szerkezete (cukor, foszforsav és négyféle szerves bázis) túl egyszerűnek tűnt ahhoz, hogy ekkora mennyiségű információt hordozzon. • A fehérjék ezzel ellentétben 20 féle aminosavból épülnek fel, ami első ránézésre sokkal nagyobb lehetőségekkel bír genetikai információ tárolására. • Tetszetős teóriának tűnt, hogy a kromoszómák fehérjéi mintaként/templátként szolgálnak a szervezet fehérjéinek szintéziséhez. • Végül is több kísérleti eredmény nyomán egyértelművé vált, hogy a DNS az örökítő anyag, amely meghatározza a fehérjék szerkezetét. • Nézzük meg azokat a — mára már klasszikus – kísérleteket, melyek a legdöntőbb bizonyítékokat szolgáltatták a DNS mint örökítő anyag felfedezéséhez.

29. 7.1 Griffith baktériumtranszformációs kísérlete Az első kísérleti eredményt, amely alapvetően megrengette a fehérjébe vetett hitet Frederick Griffith kísérlete szolgáltatta. Griffith, angol mikrobiológus az első világháborút követő tüdőgyulladás-járvány megfékezésére vakcina kifejlesztésén dolgozott. (A penicillint ebben az évben fedezi fel A. Flemming). Vakcinát ugyan nem sikerült kifejleszteniük, viszont egy olyan különleges jelenséget — nevezetesen a baktérium transzformációt — fedeztek fel, ami alapvetően megváltoztatta a DNS-ről alkotott addigi képet. A kísérlet során Griffith a tüdőgyulladást okozó baktérium (Streptococcus pneumoniae) két törzsével dolgozott. Az ún. S (smooth) törzs virulens/betegséget okozó volt és nevét az agar-lemezen kifejlődő nyálkás, sima telepeiről kapta. Az S törzs virulenciája a baktériumsejtet körülvevőpoliszaharid toknak tulajdonítható, amely megvédi a baktériumot az immunredszer sejtjeinek támadásától. Pontosabban a makrofágok kisebb hatékonysággal tudják őket bekebelezni, a nyálkás tok miatt, szinte kicsúszik a kezükből, szájukból. Az ún. R (rough) törzs, nem okozott betegséget, avirulens volt és a nevét a durvább felszínű telepeinek megjelenéséről (rough) kapta.

30. Griffith baktériumtranszformációs kísérlete Griffith avirulens S törzset injektálta az egerekbe, melyek a kifejlődő tüdőgyulladásban elpusztultak. (Ma már tudjuk, hogy poliszaharid tok megvédi a baktériumokat a makrofágok támadásától.) Az élő R törzsből származó baktériumokkal fertőzte meg az egereket, melyek ezúttal sikeresen megúszták a kezelést és nem betegedtek meg. Elölt S baktériumokat injektált az egerekbe, melyek az élettelen baktériumoktól — érthető módon — nem betegedtekmeg. A negyedik kísérlet szokatlan és meglepő eredményt szolgáltatott. A kísérlet során, amikor az egereket hővel elölt S baktériumok és élő R baktériumok keverékével oltotta be, az egerek tüdőgyulladásban elpusztultak. Az elpusztult egerek véréből nagy mennyiségű, az S törzs jellegzetességeit (nyálkás tokot) mutató, baktériumot tudott izolálni.

31. Griffith baktériumtranszformációs kísérlete A kísérlet eredményéből levont következtetés: Griffith ezekből az eredményekből azt a következtetéstvonta le, hogy az elpusztultS baktériumok jelenlétében az R baktériumok átalakultak/transzformálódtak S baktériumokká. Az a tény, hogy az R-ből S-be transzformált baktériumok tovább szaporodva S baktériumokat hoztak létre, azt mutatja, hogy a változás örökletes volt. Mindez úgy is megfogalmazható, hogy valamilyen genetikai információt hordozó molekula jutott át az elpusztult S baktériumokból az R baktériumokba. Az átjutott genetikai információ alapján tudtak az eredetileg tok nélküli R baktériumsejtek tokot termelni, és mint láttuk, ez a képességük örökletesnek bizonyult, mert további S baktériumokat hoztak létre. A jelenséget baktérium-transzformációnak nevezték el. Mindig ilyen fényes tokról álmodtam! Hővel elölt S baktérium R-ből S-be transzformált baktérium újonnan növesztett tokjával. A nagy kérdés még mindig nyitva maradt: DNS vagy fehérje az örökletes információt átvivő molekula, amely a transzformációért felelős.

32. 7.2 O. Avery, C. McLeod, M. McCarty kísérlete A transzformációért felelős molekula azonosítását 1944-ben a Rockelfeller Egyetem kutatói: Osvald Avery, Colin McLeod és Maclyn McCarty végezték el. A kísérlet célja:Kémiailag meghatározni a transzformációért felelős vegyületet. Hipotézis:A baktériumtranszformációért felelős vegyület a DNS. A kísérlet menete: következő dia. Következtetés: A kísérlet eredményei egyértelműen bizonyították, hogy a DNS felelős a transzformáció jelenségéért.

33. O. Avery, C. McLeod, és M. McCarty kísérlete 1. A hővel elölt virulens S törzsbaktériumokból sejtmentes kivonatot készítettek. 2.A virulens S baktériumból készített sejtmentes kivonatot egyenként RNS-t, fehérjét és DNS-temésztő enzimekkelkezeltek. 3.Az RN-ázzal kezelt kémcsőben az RNS emésztődött meg, a másik kémcsőben a proteáz a fehérjét bontotta le, míg a harmadikban a DN-áz a DNS-t emésztette meg. RNáz Proteáz DNáz 4.Az egyes enzimekkel kezelt Skivonatot egyenként R variáns baktérium szuszpenziókhoz keverték, majd megvizsgálták a baktériumtenyészetet, hogy találnak-e transzformált S variáns baktériumokat. R törzs 5. Csak abban az esetbennem találtak S variáns baktériumokat, amelyikben a virulens baktériumból készült kivonatot DN-ázzal kezelték. Ez azt jelentette, hogy a DNS emésztődött meg és így nem volt jelen a kivonatban. 6.A másik két esetben, ahol vagy az enzimek vagy az RNS, vagy a fehérjét emésztették meg (tehát mindkét esetben tartalmazott DNS-t), mindig találtak transzformáns egyedeket.

34. 7.3 Hershey-Chase kísérlet Hershey-Chase kísérlete (1952.) szolgáltatta a végső bizonyítékot arra vonatkozóan, hogy a DNS az örökítő anyag. Kísérletük modellszervezetének egy baktériumot támadó vírust, az ún. T2 bakteriofágot választották. A fágok egyszerű felépítésűek, mindössze egy fehérjetokból/köpenyből és az ebben található DNS molekulából állnak. Ismert volt, hogy a T2 bakteriofág az Escherichia coli baktériumot fertőzi meg és a baktériumsejttel több szász vírusrészecskét szintetizáltat, amelyek a sejtet feloldva kiszabadulnak. Nyilvánvaló, hogy a fágfertőzés során a fág az örökítő anyagot juttatja be a baktériumsejtbe, amely a genetikai információt tartalmazza a vírusrészecskék legyártásához. A kísérlet célja: Megvizsgálni, hogy a DNS vagy a fehérje-e az örökítő anyag, amelyik bejut a baktériumsejtbe és a genetikai információt szolgáltatja az új T2 fágok szintéziséhez. Hipotézis: A DNS az örökítő anyag, amelyet a vírus bejuttat a baktériumba. Kísérlet menete: következő dia Következtetés: Mivel a baktériumok radioaktivitását a jelölt DNS okozta, a vírus a DNS molekuláját injektálta a baktériumba, tehát a genetikai információt hordozó vegyület a DNS. Martha Chase és Alfred Hershey

35. A T2 bakteriofág reprodukciós ciklusa Bakteriofág T2 Fehérje köpeny DNS DNS vagy fehérje jut be a bakériumsejtbe???

36. Mivel foszfort csak a DNS tartalmaz, a radioaktiv foszfor (P) jelenlétében szaporodó fág csak a DNS-ébe építi be a radioaktív 32P-t, tehát csak a DNS-e lesz radioaktív. Mivel ként csak a fehérjék tartalmaznak, a radioaktív kén (S) jelenlétében szaporodó fág csak a fehérje tokjába építi be a 36S-t, tehát csak a fehérje tok lesz radioaktív. 1. A radioaktívan jelölt vírusok megfertőzik a baktériumokat. 2. A mixer rázó hatása elválasztja a baktériumtól a vírusnak azt a részét, amely a baktériumon kívül maradt. 3. Centrifugálás hatására a baktériumsejtek a kémcső aljára (pellet) ülepednek, míg a vírusrészecskék a felülúszóban maradnak. Következtetés: Mivel csak a fehérjét jelöltük radioaktívan, a felülúszóban a radioaktivitást (a baktériumsejteken kívül!!!) a vírus fehérjetok része okozta, ami bizonyítja, hogy a fehérje nem lehet az örökítő anyag. Következtetés: Mivel csak a DNS-t jelöltük radioaktívan, a radioaktivitást a baktériumsejtekbe jutott vírus DNS okozta, ami bizonyítja, hogy a DNS az örökítő anyag. Eredmény: Legtöbb radioaktivitás a pelletet alkotó baktériumsejtekben volt mérhető. Eredmény: A legtöbb radioaktivitás a felülúszóban lévő vírus részecskékben volt mérhető.

37. A Hershey – Chase kísérlet egyértelműen bebizonyította, hogy… a fág a DNS-ét juttatja, be a baktériumsejtbe így tehát … a DNS az örökítő anyag.

38. 8. Milyen a DNS szerkezete?

39. Milyen a DNS szerkezete? • Most, hogy minden kétséget kizáróan bebizonyosodott, hogy a genetikai információt a DNS hordozza, egyre sürgetőbbé vált annak megismerése, hogy valójában milyen is a DNS szerkezete. • Valamennyi kísérleti eredmény, adat és elméleti megfontolás, amelyek alapján a DNS szerkezetére sikerült fényt deríteni, alapvetően három fő forrásból eredt: • Kémiai vizsgálatok • Röntgendiffrakciós vizsgálatok (Röntgensugár-elhajlás) • Modellépítés

40. 8.1 A DNS szerkezete, kémiai vizsgálatok A foszforsav a dezoxiribóz 5’C atomjához egy foszfátészter kötéssel kapcsolódik. Szerves bázis adenin Foszfát csoport A szerves bázis a dezoxiribóz molekula 1’ C atomjához kapcsolódik egyN-glikozidos kötéssel. dezoxiribóz A DNS molekula alapegysége/monomerje a nukleotid, amely egy dezoxiribózból, a négy szerves bázis egyikéből és egy foszforsavból áll. A négy szerves bázis (nitrogéntartalmú heterociklikus vegyület), melyek közül kettő puringyűrűs (purinbázis): Adenin és Guanin; kettő pirimidingyűrűs (pirimidinbázis): Timin és Citozin

41. A DNS szerkezete, kémiai vizsgálatok A polinukleotid láncnak megkülönböztetjük a két végét. Az egyik az ún. 5’ vég, amelyen a pentóz 5’C atomjának hidroxilcsoportja egy foszforsavval foszfátészter kötést képez. Apolinukleotid úgy épül fel, hogy a lánchoz kapcsolódó nukleotid foszfátcsoportja (amelyik a dezoxiribóz 5’C atomjához kapcsolódik észterkötéssel) szintén észterkötést alakít ki a lánc végén található nukleotid 3’C atomján elhelyezkedő hidroxilcsoporttal. A két nukleotidot így egy foszfodiészter kötés kapcsolja össze. A másik a 3’ vég, amelyen a dezoxiribóz 3’C atomjához egy hidroxilcsoport (-OH) kapcsolódik.

42. A DNS szerkezete, kémiai vizsgálatok szabad 3’OH 5’ foszfát csoport A lánc mindig az 5’ 3’ irányba tud nőni, ami azt jelenti, hogy az új nukleotid mindig a lánc szabad 3’OH csoportjához kapcsolódik az 5’ foszfát OH-csoportjával, melyek között észterkötés alakul ki. A két nukleotidot így egy foszfodiészter kötés kapcsolja össze.

43. 8.2 A DNS szerkezete, röntgendiffrakciós vizsgálatok A röntgendiffrakciós vizsgálati módszer kiemelkedő képviselője volt Rosalind Franklin és Maurice Wilkins, akik a korábbiaknál sokkal pontosabb és jobb minőségű röntgendiffrakciós képeket tudtak készíteni a DNS-ről. Az általuk készített képek és az azokból nyert adatok nagymértékben hozzájárultak a DNS molekula 3D szerkezetének felfedezéséhez. Rosalind Franklin Maurice Wilkins

44. A DNS szerkezete, röntgendiffrakciós vizsgálatok A módszer lényege, hogy a vizsgálandó anyagra röntgensugarakat bocsátanak, melyek szóródnak, elhajlanak az atomok elektronburkain, valamint az atomokról szóródó sugarak interferálnak is egymással, ami miatt kis foltokból, koncentrikus körökből álló mintázat rajzolódik ki a sugárzás útjába helyezett fényérzékeny lemezen. A foltok és körök helyzetéből és intenzitásából következtetni lehet az elhajlás mértékére, abból pedig a vizsgált anyagban az atomok helyzetére, elrendezésére. A röntgendiffrakciós képek alapján nem könnyű meghatározni az atomok helyzetét, különösen akkor, ha a molekula nagy méretű.

45. A DNS szerkezete, röntgendiffrakciós vizsgálatok • A röntgendiffrakciós képek alapján a DNS molekula szerkezetéről az alábbi következtetéseket lehetett levonni. • A DNS egy hosszú vékony molekula, amely spirálisan fel van tekeredve egy képzeletbeli hengerpalást mentén. Ezt az alakzatot nevezzük hélixnek. • A hélix/henger átmérője 2 nm. • A hélix egy teljes menetének magassága 3,4 nm • Két egymás utáni nukleotid távolsága0,34 nm, ami azt jelenti, hogy egy teljes fordulat 10 bázispár hosszú. • A molekula sűrűsége és a hélix átmérője alapján arra lehetett következtetni, hogy a hélix két polinukleotid szálból áll.

46. 8.3 A DNS szerkezete, modell építés • James Watson amerikai genetikus és Francis Crick angol fizikus volt az a két kutató, akik az addig összegyűjtött adatokra támaszkodva, figyelembe véve a molekulák méretét, egymástól való távolságát, kötésszögeit, megépítették a DNS molekula térbeli modelljét. Fémlapok és drótok képviselték a DNS-t alkotó molekulákat és a kémiai kötéseket.

47. A DNS szerkezete, modell építés • A két szál egymással ellentétes irányban futés a bázisok a spirál belseje felé néznek. • A két szál (cukor-foszfát gerinc) közötti távolság éppen annyi, hogy egy purin és egy pirimidin bázis illik bele egymással szembeállítva. • A bázisok gyűrűje által meghatározott sík a henger tengelyére merőleges. • A bázisok szigorú bázispárosodási szabály szerint csak A-T és G-C párokat alkothatnak. Az adenin csak a timinnel, a guanin pedig a citozinnal állhat párba. • A bázispárosodási szabály miatt az egyik szál bázissorrendje pontosan meghatározza a másik szál bázissorrendjét. A két szál tehát komplementer. • A két szálat az egymással szemben álló, komplementer bázisok között kialakuló hidrogénhidak tartják össze. A guanin és citozin között három hidrogén kötés, az adenin és timin között két hidrogénkötés alakulhat ki. • A két szál bázisai csak úgy kerülhetnek megfelelő helyzetbe ahhoz, hogy hidrogénkötéseket alakítsanak ki, ha a cukormolekulák, melyekhez kapcsolódnak, az ellenkező irányba néznek. A két szál tehát ellentétes lefutású vagy más szóval antiparallel.