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1. Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele muva kempten
Dr. Monika Knödlseder
2. Beispiele:
Bifidobakterien
Laktobazillen
Cronobacter
PCR
3.
Bifidobakterien
4. Bifidobakterien
werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt
keine „offizielle“ spezifische Nachweismethode für Bifidobakterien
ISO-Vorschlag in Bearbeitung ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)
5. Bifidobakterien ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)
Für Milchprodukte
IDF – Ringversuch 2006 21 Labore (Europa, Japan und Neuseeland)
Nährboden TOS-MUP Medium TOS Agar mit Li Mupirocin (MUP)
Begleitflora wird gehemmt (Streptococcus thermophilus, Laktobazillen)
Wachstum von Bifidobakterien wird gefördert
6. Bifidobakterien Nachweis mit TOS-MUP-Agar:
7. Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie
8. Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien - Methodenvergleich
9. Bifidobakterien
10. Bifidobakterien Zusammenfassung
ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:
11. Bifidobakterien Nachteil:
Bezug des Nährbodens in Japan
kein europäischer Anbieter (derzeit)
12.
LAKTOBAZILLEN
13.
gleiche Methode – gleiche oder unterschiedliche Ergebnisse ?!
am Beispiel LAKTOBAZILLEN
14. Laktobazillen Nachweis von Laktobazillen –
Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)
15. Laktobazillen
16. Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse
17. Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse
18. Laktobazillen Zusammenfassung:
Die Vergleichsuntersuchungen von über 80 Proben (4 Hersteller) mit Merck- und Difco-Agar
bei der Mehrheit (über 80%) der untersuchten Proben vergleichbare Keimzahl und FTIR-Identifizierungsergebnis
19. Laktobazillen Zusammenfassung:
Aber:
in produktabhängigen Einzelfällen (4) führte die Verwendung unterschiedlicher MRS - Nährmedien zu deutlichen Abweichungen (über 80%) in der Keimzahl
bei ca. 95 % der Proben keine Abweichungen bei der FTIR - Analyse (identischen Spezies)
bei ca. 5 % der Proben keine eindeutige Übereinstimmung in der FTIR - Analyse (als Option)
20.
Cronobacter – E. sakazakii
21. Enterobacter sakazakii ISO/TS 22964IDF/RM 210:2006
22.
23. Cronobacter Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung
Optimierung des Verfahrens
Horizontales Verfahren
Derzeit in der Diskussion:
Inkubation der Selektivmedien 22-26 h bei 41,5 ± 1 °C
Austausch der Selektivmedien
Cronobacter screening broth (CSB) (anstelle mLST)
Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar (anstelle Enterobacter sakazakii isolation agar)
24.
PCR - Verfahren
26. PCR / real – time PCR
Wie geht man mit positiven Befunden um?
Was macht man, wenn der Keim nicht isoliert werden kann?
27. PCR Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaftlichen Lebensmittelhygienerechts
Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern (= Umsetzung der Richtlinie 2003/99/EG)
(2) Im Falle des Nachweises von Zoonoseerregern sind….
Isolate der nachgewiesenen Zoonoseerreger herzustellen
die Rückstellproben des Probenmaterials
die Isolate
während eines von der zuständigen Behörde festzusetzenden Zeitraumes, jedoch nicht länger als drei Monate, in geeigneter Weise aufzubewahren
der zuständigen Behörde auf Verlangen vorzulegen und auszuhändigen.
28.
Was tun?
29. Kompetenz des Labors Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen
Laborkompetenz: Bsp.
Ringversuche
Interne Kontrollen
Prüfmittelüberwachung
Schulung - Laborbegehungen
Qualitätssicherung im Labor
Mikrobiologisches Fachwissen
30. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
31. 5.3 Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar
5.3.1 Composition
Tryptic digest of casein
Yeast extract
Sodium chloride (NaCl)
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-glucopyranoside
Sodium desoxycholate (C24H39NaO4)
Ammonium iron(III) citrate (C6H8O7 Fe NH3)
Sodium thiosulfate (Na2S2O3)
Agar
Water
Kein Crystal violet
32. 5.2. Cronobacter screening broth (CSB)
5.2.1 Base medium
Enzymatic digest of animal tissues
Meat extract
Sodium chloride (NaCl) (weniger)
Bromocresol purple
Sucrose (C12H22O11)
Water
5.2.2. Vancomycin solution
33. Bifidobakterien –Nährmedien Nachweis von Bifidobakterien: Nährmedienzusammensetzung
34. Laktobazillen - Nährmedien Laktobazillen – Verwendung von MRS-Agar verschiedener Hersteller
36. Zählung der Kolonien und Angabe des Ergebnisses:
Zählung der Verdünnungsstufen mit mindestens einmal > 15 bis 300 Kolonien
Alle Kolonien werden gezählt
Bildung des gewogenen arithmetischen Mittels der Keimzahlwerte von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe des Ergebnisses als KbE /ml oder KbE/g
Sind in der Anfangsverdünnung weniger als 15 Kolonien gewachsen, werden alle Kolonien gezählt und das arithmetische Mittel gebildet
37. Kompetenz des Labors Externes, akkreditiertes Labor: für die entsprechenden Untersuchungsverfahren akkreditiert? Erfahrung mit der entsprechenden Probenmatrix vorhanden?
Anerkanntes (akkreditiertes) Betriebslabor? Ist die Methode validiert? Nimmt das Labor erfolgreich an Ringversuchen/ Vergleichsuntersuchungen teil?
Welche Untersuchungsverfahren wurden eingesetzt? (Betriebsinterne Methoden; Referenz-, validierte Schnellmethoden)
38. In der Praxis häufig als obligates Lebensmittelsicherheitskriterium eingestuft ?
Verweis auf Kapitel 2.2 des Anhangs:
2.2.3. Käse aus Rohmilch2.2.4. Käse aus Milch, wärmebehandelt …..2.2.5. Frischkäse aus Milch … , wärmebehandelt ….2.2.7. Milch- und Molkepulver
Bei Grenzwertüberschreitung: koagulasepositive Staphylokokken > 105 KBE/g
?
Untersuchung auf Staphylokokken-Enterotoxine: negativ in 25 g Staphylokokken-Enterotoxine (SET), Verordnung (EG) 2073/2005, Anhang I
39. Nachweis von SET- Problematik falschpositiver Ergebnisse In Abhängigkeit vom verwendeten Testkit sind falschpositive Resultate möglich:
es ist daher unumgänglich, insbesondere schwach verdächtige Ergebnisse zu verifizieren:
Zählung der Staphylokokken parallel zur SET-Bestimmung
Thermonuklease-Nachweis(Hinweis auf kritische Staphylokokken-Keimzahlen noch möglich in Proben, in denen keine Staphylokokken mehr nachweisbar sind)
Hitzebehandlung der Probe und erneute SET-Bestimmung (SET sind hitzestabil, unspezifische Reaktionen hervorrufende Substanzen sind häufig hitzelabil)
(aus: H. Becker et al. (1994), Archiv für Lebensmittelhygiene 45; 25-48)
40. Eingesetzte Volumen für die PCR
Von 5 µl bis 1 ml
BAX 5 µl
Roche 1 ml
EHEC 1 ml
41. Verordnung zur Durchführung von Vorschriftendes gemeinschaft-lichen Lebensmittel-hygienerechts Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern
§ 3: Betriebseigene Kontrollen
(1) Wer im Rahmen von Kontrollen nach Artikel 3 Abs. 1 der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 ...... oder anderen betriebseigenen Kontrollen Lebensmittel auf Zoonoseerreger untersucht, hat zum Zweck der Durchführung von weitergehenden Untersuchungen
Rückstellproben des Probenmaterials anzufertigen und bis zum Vorliegen des Ergebnisses der Untersuchungen in geeigneter Weise aufzubewahren.
42. Bifidobakterien – Methoden-vergleich
43. Bifidobakterien – Vergleichsunter-suchungen
44. Laktobazillen - Nachweis Nachweis von Laktobazillen –
Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)
45. Grenzen der Mikrobiologie:
fehlende Nachweismethode
trotz speziell angepasster Inkubationsbedingungen können (vorgeschädigte) Mirkoorganismen nicht (mehr) zum Wachstum gebracht werden
unterschiedliche Methoden zum Nachweis desselben Mikroorganismus können zu unterschiedlichen Ergebnisse führen
unterschiedliche Vorgehensweisen oder Reagenzien innerhalb einer Methode können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Bsp: Laktobazillen)
46. Methode 1 – Nachweis mit RCM-Agar: Bifidobakterien- Nachweis
47. Bifidobakterien- Nachweis Methode 2 – Nachweis mit TOS-MUP-Agar:
48. Leistungs-potentiale Moderne Methoden :
PCR:
Salmonellenanalyse ca. 1,5 - 2 Tage
Listerienanalyse ca. 2 Tage
STEC ca. 2 Tage
Cronobacter ca. 2 Tage
FTIR Analyse:
Absorption aller Zellbestandteile
? Chemische Zusammensetzung des
Keimes wird „dargestellt“
? definierte Wellenlängenbereiche werden für einen „Fingerabdruck“ des Keims ausgewertet
49. Bifidobakterien – Zusammen-fassung Nachweis von Bifidobakterien – Zusammenfassung
ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:
50. Laktobazillen
51. Probenahme-planung Festlegen aussagefähiger Probenahmestellen, Beispiele:
Der zu untersuchende Probenteil: Käserinde bei der Untersuchung auf Listeria monocytogenes
Repräsentative Probenahme / Stichproben entsprechend Anlage 1 der Verordnung (EG) 2073/2005
„kritische“ Anlagenteile unter Berücksichtigung möglicher Biofilm- bzw. Nischenbildung
Festlegen relevanter Untersuchungsparameter, Beispiel:
Schmierlösung und Gully-Inhalte auf Listerien
52. Bifidobakterien- Kolonie-morphologie Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie