Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden dargestellt anhand konkreter Beispiele

1. Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele muva kempten Dr. Monika Knödlseder

2. Beispiele: Bifidobakterien Laktobazillen Cronobacter PCR

3. Bifidobakterien

4. Bifidobakterien  werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt keine „offizielle“ spezifische Nachweismethode für Bifidobakterien ISO-Vorschlag in Bearbeitung ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)

5. Bifidobakterien ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E) Für Milchprodukte IDF – Ringversuch 2006 21 Labore (Europa, Japan und Neuseeland) Nährboden TOS-MUP Medium TOS Agar mit Li Mupirocin (MUP) Begleitflora wird gehemmt (Streptococcus thermophilus, Laktobazillen) Wachstum von Bifidobakterien wird gefördert

6. Bifidobakterien Nachweis mit TOS-MUP-Agar:

7. Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie

8. Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien - Methodenvergleich

9. Bifidobakterien 

10. Bifidobakterien Zusammenfassung ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:

11. Bifidobakterien Nachteil: Bezug des Nährbodens in Japan kein europäischer Anbieter (derzeit)

12. LAKTOBAZILLEN

13. gleiche Methode – gleiche oder unterschiedliche Ergebnisse ?! am Beispiel LAKTOBAZILLEN

14. Laktobazillen Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)

15. Laktobazillen

16. Laktobazillen  gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse

17. Laktobazillen  gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse

18. Laktobazillen Zusammenfassung: Die Vergleichsuntersuchungen von über 80 Proben (4 Hersteller) mit Merck- und Difco-Agar bei der Mehrheit (über 80%) der untersuchten Proben vergleichbare Keimzahl und FTIR-Identifizierungsergebnis

19. Laktobazillen Zusammenfassung: Aber: in produktabhängigen Einzelfällen (4) führte die Verwendung unterschiedlicher MRS - Nährmedien zu deutlichen Abweichungen (über 80%) in der Keimzahl bei ca. 95 % der Proben keine Abweichungen bei der FTIR - Analyse (identischen Spezies) bei ca. 5 % der Proben keine eindeutige Übereinstimmung in der FTIR - Analyse (als Option)

20. Cronobacter – E. sakazakii 

21. Enterobacter sakazakii ISO/TS 22964IDF/RM 210:2006

22.

23. Cronobacter Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung Optimierung des Verfahrens Horizontales Verfahren Derzeit in der Diskussion: Inkubation der Selektivmedien 22-26 h bei 41,5 ± 1 °C Austausch der Selektivmedien Cronobacter screening broth (CSB) (anstelle mLST) Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar (anstelle Enterobacter sakazakii isolation agar)

24. PCR - Verfahren

26. PCR / real – time PCR  Wie geht man mit positiven Befunden um? Was macht man, wenn der Keim nicht isoliert werden kann?

27. PCR Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaftlichen Lebensmittelhygienerechts Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern (= Umsetzung der Richtlinie 2003/99/EG) (2) Im Falle des Nachweises von Zoonoseerregern sind…. Isolate der nachgewiesenen Zoonoseerreger herzustellen die Rückstellproben des Probenmaterials die Isolate während eines von der zuständigen Behörde festzusetzenden Zeitraumes, jedoch nicht länger als drei Monate, in geeigneter Weise aufzubewahren der zuständigen Behörde auf Verlangen vorzulegen und auszuhändigen.

28. Was tun?

29. Kompetenz des Labors Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen Laborkompetenz: Bsp. Ringversuche Interne Kontrollen Prüfmittelüberwachung Schulung - Laborbegehungen Qualitätssicherung im Labor Mikrobiologisches Fachwissen

30. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

31. 5.3 Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar 5.3.1 Composition Tryptic digest of casein Yeast extract Sodium chloride (NaCl) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-glucopyranoside Sodium desoxycholate (C24H39NaO4) Ammonium iron(III) citrate (C6H8O7 Fe NH3) Sodium thiosulfate (Na2S2O3) Agar Water Kein Crystal violet

32. 5.2. Cronobacter screening broth (CSB) 5.2.1 Base medium Enzymatic digest of animal tissues Meat extract Sodium chloride (NaCl) (weniger) Bromocresol purple Sucrose (C12H22O11) Water 5.2.2. Vancomycin solution

33. Bifidobakterien –Nährmedien Nachweis von Bifidobakterien: Nährmedienzusammensetzung

34. Laktobazillen - Nährmedien Laktobazillen – Verwendung von MRS-Agar verschiedener Hersteller

36. Zählung der Kolonien und Angabe des Ergebnisses: Zählung der Verdünnungsstufen mit mindestens einmal > 15 bis 300 Kolonien Alle Kolonien werden gezählt Bildung des gewogenen arithmetischen Mittels der Keimzahlwerte von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe des Ergebnisses als KbE /ml oder KbE/g Sind in der Anfangsverdünnung weniger als 15 Kolonien gewachsen, werden alle Kolonien gezählt und das arithmetische Mittel gebildet

37. Kompetenz des Labors Externes, akkreditiertes Labor: für die entsprechenden Untersuchungsverfahren akkreditiert? Erfahrung mit der entsprechenden Probenmatrix vorhanden? Anerkanntes (akkreditiertes) Betriebslabor? Ist die Methode validiert? Nimmt das Labor erfolgreich an Ringversuchen/ Vergleichsuntersuchungen teil? Welche Untersuchungsverfahren wurden eingesetzt? (Betriebsinterne Methoden; Referenz-, validierte Schnellmethoden)

38. In der Praxis häufig als obligates Lebensmittelsicherheitskriterium eingestuft ? Verweis auf Kapitel 2.2 des Anhangs: 2.2.3. Käse aus Rohmilch2.2.4. Käse aus Milch, wärmebehandelt …..2.2.5. Frischkäse aus Milch … , wärmebehandelt ….2.2.7. Milch- und Molkepulver Bei Grenzwertüberschreitung: koagulasepositive Staphylokokken > 105 KBE/g ? Untersuchung auf Staphylokokken-Enterotoxine: negativ in 25 g Staphylokokken-Enterotoxine (SET), Verordnung (EG) 2073/2005, Anhang I

39. Nachweis von SET- Problematik falschpositiver Ergebnisse In Abhängigkeit vom verwendeten Testkit sind falschpositive Resultate möglich:  es ist daher unumgänglich, insbesondere schwach verdächtige Ergebnisse zu verifizieren: Zählung der Staphylokokken parallel zur SET-Bestimmung Thermonuklease-Nachweis(Hinweis auf kritische Staphylokokken-Keimzahlen noch möglich in Proben, in denen keine Staphylokokken mehr nachweisbar sind) Hitzebehandlung der Probe und erneute SET-Bestimmung (SET sind hitzestabil, unspezifische Reaktionen hervorrufende Substanzen sind häufig hitzelabil) (aus: H. Becker et al. (1994), Archiv für Lebensmittelhygiene 45; 25-48)

40. Eingesetzte Volumen für die PCR Von 5 µl bis 1 ml BAX 5 µl Roche 1 ml EHEC 1 ml

41. Verordnung zur Durchführung von Vorschriftendes gemeinschaft-lichen Lebensmittel-hygienerechts  Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern § 3: Betriebseigene Kontrollen (1) Wer im Rahmen von Kontrollen nach Artikel 3 Abs. 1 der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 ...... oder anderen betriebseigenen Kontrollen Lebensmittel auf Zoonoseerreger untersucht, hat zum Zweck der Durchführung von weitergehenden Untersuchungen Rückstellproben des Probenmaterials anzufertigen und bis zum Vorliegen des Ergebnisses der Untersuchungen in geeigneter Weise aufzubewahren.

42. Bifidobakterien – Methoden-vergleich

43. Bifidobakterien – Vergleichsunter-suchungen

44. Laktobazillen - Nachweis Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)

45. Grenzen der Mikrobiologie: fehlende Nachweismethode trotz speziell angepasster Inkubationsbedingungen können (vorgeschädigte) Mirkoorganismen nicht (mehr) zum Wachstum gebracht werden unterschiedliche Methoden zum Nachweis desselben Mikroorganismus können zu unterschiedlichen Ergebnisse führen unterschiedliche Vorgehensweisen oder Reagenzien innerhalb einer Methode können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Bsp: Laktobazillen)

46. Methode 1 – Nachweis mit RCM-Agar: Bifidobakterien- Nachweis

47. Bifidobakterien- Nachweis Methode 2 – Nachweis mit TOS-MUP-Agar:

48. Leistungs-potentiale Moderne Methoden : PCR: Salmonellenanalyse ca. 1,5 - 2 Tage Listerienanalyse ca. 2 Tage STEC ca. 2 Tage Cronobacter ca. 2 Tage FTIR Analyse: Absorption aller Zellbestandteile ? Chemische Zusammensetzung des Keimes wird „dargestellt“ ? definierte Wellenlängenbereiche werden für einen „Fingerabdruck“ des Keims ausgewertet

49. Bifidobakterien – Zusammen-fassung Nachweis von Bifidobakterien – Zusammenfassung ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:

50. Laktobazillen

51. Probenahme-planung Festlegen aussagefähiger Probenahmestellen, Beispiele: Der zu untersuchende Probenteil: Käserinde bei der Untersuchung auf Listeria monocytogenes Repräsentative Probenahme / Stichproben entsprechend Anlage 1 der Verordnung (EG) 2073/2005 „kritische“ Anlagenteile unter Berücksichtigung möglicher Biofilm- bzw. Nischenbildung Festlegen relevanter Untersuchungsparameter, Beispiel: Schmierlösung und Gully-Inhalte auf Listerien

52. Bifidobakterien- Kolonie-morphologie Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie