Chương 1 : KỸ THUẬT PHÂN TÁCH

1. Chương 1: KỸ THUẬT PHÂN TÁCH

2. 1.1. Phân tích sắc ký 1.1.1. Nguyên lý cơ bản - Sắc ký là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối pha tĩnh và pha động + pha tĩnh: có tác dụng giữ cấu tử cần tách (lớp chất cố định) + pha động: có tác dụng kéo cấu tử cần tách ra khỏi cột (chất lỏng, khí)

3. PPPT sắc ký • Được phát minh vào năm 1903 bởi Tswett (1872-1919) • Ưu điểm: + khả năng phân tách cao, có thể tách những chất rất giống nhau về mặt hóa học lẫn vật lý + là 1 trong những PPPT mạnh nhất

4. Cột sắc ký

5. Thứ tự ra khỏi cột • Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước • Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau

6. Sắc ký đồ

7. Phân loại sắc ký Phân loại dựa trên trạng thái của pha động: • Sắc ký lỏng: + pha động: chất lỏng + pha tĩnh: rắn, lỏng • Sắc ký khí + pha động: chất khí + pha tĩnh: rắn, lỏng

8. Phân loại sắc ký Theo cơ chế của quá trình tách: • Sắc ký hấp phụ • Sắc ký phân bố • Sắc ký trao đổi ion • Sắc ký rây phân tử

9. Các đại lượng cơ bản t R t’R t M W

10. Thời gian lưu tR , thể tích lưu VR - Sắc đồ: kết quả của quá trình tách sắc ký. Mỗi peak của sắc đồ ứng với 1 hoặc 1 nhóm cấu tử của hỗn hợp cần tách. - Thời gian lưu tR: thời gian từ khi tiêm mẫu đến khi ghi nhận được cực đại của mũi sắc ký - Thời gian lưu chết tM: thời gian 1 chất hoàn toàn không tương tác với pha tĩnh hay cũng là thời gian di chuyển của pha động từ đầu cột đến cuối cột.

11. Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R , thể tích lưu hiệu chỉnh V’R Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R: là thời gian chất bị lưu giữ trong pha tĩnh tR = t’R + tM = tM (1+K’) VR = VM (1+K’) - Thời gian lưu và thể tích lưu hiệu chỉnh của mẫu: t’R = tR - tM V’R = VR - VM

12. Hệ số phân bố K • CS : nồng độ chung của chất tan trong pha tĩnh • CM : nồng độ của chất tan trong pha động • K càng lớn nghĩa là chất bị hấp phụ càng nhiều, chất chuyển động càng chậm • K chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan, pha tĩnh và nhiệt độ mà không phụ thuộc vào kiểu cột tách

13. Hệ số chứa (dung lượng) K’ • nS, nM : số mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động • b : tỉ số pha • t’R : thời gian lưu hiệu chỉnh • tM : thời gian chết - K’ biểu diễn mối tương quan giữa thời gian của chất tan lưu lại trong pha tĩnh so với trong pha động. - K’ lớn: cột tách tốt nhưng thời gian phân tích kéo dài và vùng bị giãn rộng

14. Số đĩa lý thuyết N trong cột sắc ký Biết: d : độ lệch chuẩn của peak - Trong TH lý tưởng, peak có dạng hình Gauss, ta có độ rộng của peak: +tại điểm uốn: Wi = 2 d +tại một nửa chiều cao: Wh = 2,355d + tại đáy peak: Wb = 4 d - Ta có các công thức sau:

15. Số đĩa lý thuyết N trong cột sắc ký • N càng lớn nghĩa là số lượng các cân bằng tăng thì hiệu quả phân chia trên cột sắc ký tăng lên, bề rộng đáy càng nhỏ, peak càng nhọn, định lượng chúng càng chính xác. • Sắc ký lỏng: N < 20.000 • Sắc ký khí: N > vài trăm ngàn ? Sắc ký khí tách tốt hơn sắc ký lỏng ? - Chiều cao tương đương với đĩa lý thuyết: H = L / N L: chiều dài cột sắc ký

16. Độ chọn lọc a • Độ chọn lọc a : dùng để đánh giá 2 chất có tách được hay không • a: phụ thuộc vào pha tĩnh, pha động và bản chất của chất tan • Pha tĩnh phải có cùng bản chất với chất tan để giữ chúng lại

17. Hệ số phân giải Rs • Hệ số phân giải Rs: dùng để đánh giá 2 peak liên tiếp có thể tách được hay không (tốt nhất Rs = 1,5)

18. Khả năng tách các chất • Biểu thức liên hệ giữa 4 đại lượng trên:

19. Ứng dụng của PP sắc ký • Định tính Cấu tử được tính theo giá trị tR. So sánh tR của mẫu và tR của cấu tử chuẩn trong cùng đk đo trên máy. • Định lượng: bằng cách so sánh với dd chuẩn: • Chiều cao h của mũi (hẹp và đối xứng) • Diện tích mũi S

20. Các ứng dụng của sắc ký • Phân tích dựa vào chiều cao peak • Phân tích dựa vào diện tích peak • Xây dựng đường chuẩn (calibration with standards) • Phương pháp chuẩn nội (internal-standard)

21. Máy sắc ký GC – máy sắc ký khí HPLC – máy sắc ký lỏng sắc ký trao đổi ion

22. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Sắc ký khí Gas-Liquid Chromatography (GLC) hoặc là Gas Chromatography (GC) • Bốc hơi mẫu • Tách các cấu tử trong cột nhờ vào sự phân bố trong pha động và pha tĩnh • Pha động: pha khí (N2, He, Ar…) • Pha tĩnh: pha rắn hoặc pha lỏng phủ lên pha rắn được giữ ở trong cột • Phương pháp công cụ để phân tách và xác định các hợp chất hóa học

23. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) • Mẫu (sample) phân tích được: • Đưa vào bộ phận nạp mẫu (heated injector) • Di chuyển qua một cột phân tách (seperating column) nhờ một dòng khí mang trơ (inert carrier gas) • Phát hiện và ghi lại • dưới dạng các peaks • khi các cấu tử đi ra • khỏi cột

24. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography)

25. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Nguồn cung cấp khí mang (Carrier Supply) F = 25 – 150 ml.min-1: Cột nhồi (Packed column) F = 1 – 25 ml.min-1: Cột mao quản (Open-tubular or Capillary column) • N2: chi phí thấp, an toàn • H2: chi phí thấp, nguy cơ cháy nổ • He: thông thường, đắt • Ar: Bình chứa áp suất cao (pressurized tank) - Dụng cụ điều chỉnh áp suất (pressure regulator) - Điều khiển lưu lượng dòng khí (Flow controller) Two stages pressure regulator

26. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Nguồn cung cấp khí mang (Carrier Supply) Thiết bị tách N2 từ không khí nén (Pure Nitrogen Generator) - Thẩm thấu chọn lọc N2 - 0.5 ppm O2, > 0.5 ppm H2O, > 2.0 ppb halocarbons hoặc CxHy. - Lưu kương tối đa  1 l/min. Áp suất 3,5 – 7 atm. Thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất (Hydrogen Generators) - Phương pháp điện phân (Electrolysis) - Chất điện ly: polymer rắn (solid polymer electrolyte) - H2 99.999% - Khả năng lưu trữ H2: 4 litre - Áp suất: 1,4 – 7 atm. - Lưu lượng: 0 to 125 ml.min-1 và có thể đạt đến 1200 ml.min-1.

27. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Hệ thống nạp mẫu (Sample Injection system) Các yêu cầu: - Lượng mẫu thích hợp - Tốc độ nạp mẫu phải nhanh và mẫu nạp khi vào cột ở trạng thái khí Giảm sự giãn peak (band broadenning) và tăng độ phân giải của cột • Microsyringe chuẩn (calibrated) • Septum: màng bằng cao su silicone • Gia nhiệt cho vùng nạp mẫu: T > 50°C của cấu tử có nhiệt độ sôi cao nhất • Thể tích nạp mẫu: 20 l đối với cột nhồi (packed column) •  0,2 l hoặc nhỏ hơm đối với mao quản (open-tubular or capillary column)

28. B. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Lò ổn nhiệt Cột sắc ký Ổn nhiệt cột săc ký (Column Thermostating) Mục đích: Bảo đảm tính lặp lại của thời gian lưu Isothermal: mẫu đơn giản Lò ổn nhiệt (thermostating oven) Topti.= f(Tsôi), Topti Tsôi với RT= 2 – 30 phút Nhiệt độ chương trình hóa (Temperature Programming) Mẫu phức tạp: Tách các cấu tử của mẫu dựa vào sự thay đổi của T sôi

29. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Chương trình hóa nhiệt độ Hệ số khả năng Độ phân giải So sánh sắc ký đồ ở hai chế độ: Isothermal và chương trình hóa nhiệt độ

30. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Các vùng có gia nhiệt của hệ sắc ký khí (GC)

31. Kỹ thuật sắc ký Một trong các thành phần cơ bản nhất: Detector (bộ dò tín hiệu). Chia 4 loại: • Detetor ion hóa mẫu FID (ion hóa ngọn lửa) • Detetor dựa vào tính chất vật lý TCD (dẫn nhiệt). • Detetor quang học FPD • Detetor điện hóa ECD (công kết điện tử) Tín hiệu của Detetor phụ thuộc đặc tính của chúng. Detector nhạy cảm nồng độ tín hiệu nhận được phụ thuốc tốc độ dòng khí đi qua: TCD, ECD, FPD.

32. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Đầu dò (Detectors) • Một số yêu cầu: • Tín hệu thu đươc tuyến tính hoặc gần tuyến tính với lượng mẫu • Thời gian trả lời nhanh • Phát hiện đa dạng (universal detection) • Tín hiệu ra không phụ thuộc và nhiệt độ • Làm việc ổn định từ nhiệt độ thường đến 400°C (đối với GC) • Thermal Conductivity Detector (TCD) • Flame Ionization Detector (FID) • Electron Capture Detector (ECD) • Nitrogen-Phosphorous Detector (NPD) • Flame Photometric Detector (FPD): FID tweaked for S compounds • Photoionization Detector (PID)

33. Detector dẫn nhiệt (TCD) • Detector TCD dựa vào tính chất độ điện dẫn. • Nguyên tắc: đo liên tục độ dẫn nhiệt của khí mang (tinh khiết hoặc chứa cấu tử tách) giữa buồng đo và buồng so sánh có lắp các dây điện trở Vonfram hoặc Platin. • Được ứng dụng rộng rãi có thể xđ hầu hết các chất tách từ cột sắc ký. • Nhạy cảm nồng độ, giới hạn phát hiện 10-9g/ml. • Độ dẫn điện của He, H2 lớn hơn 6 – 10 lần so với các hợp chất hữu cơ.

34. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Thermal Conductivity Detector (TCD) • Measures heat loss from a hot filament – nearly universal • Filament heated to const T • When only carrier gas flows heat loss to metal block is constant, filament T remains constant • When an analyte species flows past the filament generally thermal conductivity goes down, T of filament will rise. (resistance of the filament will rise). Sơ đồ nguyên lý

35. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Thermal Conductivity Detector (TCD)

36. Detector ion hóa ngọn lửa FID • Nguyên tắc: dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa H2 đặt trong một điện trường khi có chất hữu cơ chuyển qua. • Các chất hữu cơ bị oxy hóa nhờ oxy không khí tạo các ion trái dấu tương ứng, chúng chuyển về các bản điện cực nằm 2 phía ngọn lửa. CH* + O* CHO+e- - Số lượng các ion phụ thuộc H2/không khí - Detector nhạy cảm khối lượng, không nhạy với khí vô cơ N2, N2O, NO, CO2, CS2, COS - Độ nhạy là 10-12g/s, thích hợp phân tích các hydrocacbon

37. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Flame Ionization Detector (FID) Sensitive towards organics • Analyte is burned in H2/air, which produces CH and CHO+ radicals • CHO+ radicals are reduced at a cathode which produces a current proportional to the radical quantity  10-12 A • Specific for organic carbon, insensitive to inorganics, CO2, SO2 etc. • Generally DL 100x less than TCD about pg/s (flow rate dependent) • Response to specific organic depends on the number of organic carbons.

38. Detector công kết điện tử ECD • Detetor nhạy cảm nồng độ • Xác định các hợp chất chứa nhóm chức hoặc đa liên kết • Dựa trên khả năng công kết các điện tử tự do trong pha khí của dòng khí mang được ion hóa bằng tia  phát ra từ nguồn phóng xạ (63Ni) tạo ra nguồn e- và các ion phân tử khí mang M+ M +  M+ + e- Độ nhạy: khá rộng 1 – 106 Thường sử dụng phân tích thuốc trừ sâu, diệt cỏ có chứa vòng benzen clo hóa

39. Electron Capture Detector (ECD) • Sensitive to electron withdrawing groups especially towards organics containing –F, -Cl, -Br, -I also, -CN, NO2 • Nickel-63 source emits energetic electrons collides with N2 (introduced as make-up gas or can be used as carrier gas) producing more electrons: Ni-63  e-, e- + N2 2e- + N2+ • The result is a constant current that is detected by the electron collector (anode). • As an analyte flows through past the Ni-63 source, electron capture is possible by electron-withdrawing species: A + e- A- • Current decreases as a result of e- capture by analyte. This is one of the few instances in which a signal is produced by a decrease in detectable phenomenon. • Very low DL for detected species 10-15g/ml for many halogenated substances

40. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Sơ đồ nguyên lý Electron Capture Detector (ECD) The bad • Radioactive Ni-63 source • Easily contaminated with O2, H2O, sample overloading. • High maintenance device. • Highly variable response to halogenated substances • Sometimes complementary information from FID helps.

41. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Nguyên lý A/D Converter Thu thập và xử lý số liệu (Data Acquisition and Processing )

42. B. Sắc ký khí(Gas-Liquid Chromatography) Một số ứng dụng của GC (GLC) • Áp dụng đối với các mẫu bốc hơi và ổn định nhiệt đến vài trăm °C • Có khả năng phát hiện và phân tích rất nhiều chất và hỗn hợp • Được ứng dụng rộng rãi để tách và xác định các cấu tử trong các mẫu từ nhiều chủng loại khác nhau Một vài ví dụ: • Ketones: polydiméthyl siloxane • Alkaloïdes: 5% phenyl polydimethyl siloxane • Steroïds: 50% phenyl polydimethyl siloxane • Chlorinated Aromatics: 50% Trifluoropropyl polydimethyl siloxane • Alcohols: Polyethylenglycol • Esters: 50% Cyanopropyl polydimethyl siloxane • Sắc ký khí kết hợp khối phổ

43. B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) VD: nguyên lý sắc ký trao đổi ion (acide amine) Sắc ký loại trừ kích thước Phân loại HPLC dựa bản chất tương tác • Sắc ký phân bố (partition chromatography) • Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn (adsorption or liquid-solid chromatography) • Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) • Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)

44. B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Đặc điểm của HPLC Pha tĩnh được nhồi trong cột Pha động ở trạng thái lỏng: Các dung môi, hỗn hợp dung môi hoặc nước Phân loại HPLC dựa vào vật liệu nhồi • Pha thông thường (Normal phase): vật liệu nhồi là silica đơn giản • Trao đổi ion: silica biến tính (mdified silica) • Pha đảo (reverse-phase): silica biến tính Phần lớn các HPLC là pha đảo • Chất phân tích được giữ trên pha tĩnh phân cực nhỏ hơn cho đến khi bị rữa trôi bởi pha động phân cực đủ lớn • Thao tác đơn giản • Hiệu quả cao • Cột làm việc ổn định • Có thể phân tích cho cả hai loại cấu tử có đặc tính tương tự hoặc khác xa nhau

45. B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Mặc dầu có nhiều lý thuyết nghiên cứu về việc sử dụng pha đảo nhưng phần lớn các chương trình HPLC pha đảo đều thu được từ phương pháp thử và sai (by trial and error).

46. B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Pha tĩnh-Pha đảo (Stationary Phases for Reversed-Phase LC) Pha tĩnh bình thường của LC (Stationary Phases for Normal LC) • Gốc R là C8 (n-octyl), C12 (n-octyl) hoặc C18 (n-octyldecyl). • Pha động là H2O + dung môi hòa tan (acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol). • Các cấu tử phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian chạy mẫu • Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene… • Các cấu tử không phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ giảm thời gian chạy mẫu

47. B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Pha đảo Ảnh hưởng của bản chất pha tĩnh đến chất lượng tách

48. B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Sơ đồ nguyên lý của HPLC

49. B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các yêu cầu đối với dung môi • Áp suất bơm: vài trăm atm (6000psi), lưu lượng 0,1 – 10 ml.min-1 với E<0,5% • Vật liệu bơm bền ăn mòn đối với nhiều loại dung môi khác nhau • Chế độ bơm piston • Cỡ hạt trong cột sắc ký: 3 - 10m • Một hoặc nhiều bình chứa dung môi (500 ml) • Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector • Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger) • Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi • Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục

50. B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Hiệu quả tách bằng phương pháp gradient elution Quá trình tách rửa (Elution) • Sử dụng một dung môi đơn giản có thành phần không đổi: isocratic • Sử dụng hai hay nhiều hơn các hệ dung môi có độ phân cực (polarity) khác nhau nhiều: gradient elution • Tỷ lệ các loại dung môi được chương trình hóa liên tục hoặc theo từng bậc • Gradient elution: tăng chất lượng của quá trình tách (improve seperation efficiency)