Generación de mutantes en Drosophila

1. Generación de mutantes en Drosophila • Agentes mutagénicos o químicos: • mutantes puntuales • Rayos X-g : • rearreglos cromosómicos (deleciones, inversiones, translocaciones) • Movilización del elemento P (transposición): • mutantes insercionales (disrupción del gen por la inserción del P) Ventaja: mapear el sitio de inserción para identificar el gen afectado Sitio etiquetado por el P

2. Elemento P • Transposon de Drosophila capaz de movilizar dentro del genoma • Transposición no replicativa y sin intermediario • La enzima transposasa : • Es necesaria para la movilización del P, reconoce las secuencias invertidas • Es codificada por el mismo transposon o por fuente externa (otro P) • Adición o remoción para controlar los eventos de transposición • Inserción al azar dentro del genoma (no es por recombinación homóloga) • Herramienta genética para manipulear el genoma de Drosophila

3. Elemento P como herramienta genética y molecular Uso de colección de moscas depende del objetivo planteado Identificar genes involucrado en determinada función biológica Desregular la expresión de genes o generar mutación insercional 2) Identificar genes que se expresen en determinado tejido Reportar la expresión de genes 3) Expresar secuencia clonada en el P en un determinado tejido

4. Líneas transgénicas estables • Elemento P (modificado molecularmente) : • Repeticiones invertidas para transponer • No contiene transposasa • Marcador white+ en background white wild type white

5. Colección de mutantes insercionales moscas con elemento P x moscas con transposasa a movilizar (P modificado) Transposición no replicativa en el embrión Mosaico P transpuesto en algunas células (parche rojo) Progenie: cada individuo posee el P insertado en algún lugar al azar dentro del genoma Es importante remover la fuente de transposasa realizando un 2º cruzamiento Colección de mutantes insercionales Mapear el P en cada línea de la colección

6. Objetivo: Identificar genes involucrados en determinada función biológica Screen o búsqueda genética empleando una colección de mutantes Colección de moscas: conjunto de moscas que poseen elemento P insertado al azar en el genoma ventajas del elemento P Testear todas las líneas que conforman la colección de moscas Seleccionar las líneas que presentaron el fenotipo buscado Mapear el elemento P en la línea de mosca seleccionada

7. Mapeo del sitio de inserción del P dentro del genoma -genético (cromosoma, región) -citológico (hibridación in situ en cromosomas politénicos) -molecular (rescate plasmídico) Rescate plasmídico: Digestión del DNA genómico Ligación Amplificación por PCR con primers específicos en el P Secuenciación Identificar el sitio de inserción en el genoma de Drosophila