Analýza proteinů SDS PAGE elektroforézou

1. Analýza proteinů SDS PAGE elektroforézou

2. http://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4&feature=fvwrel http://www.youtube.com/watch?v=pnBZeL8nFEo

3. Molekulárně biologická diagnostika • Diagnostika na úrovni DNA, RNA a proteinů • Analýza genomu, transkriptomu, proteomu, příp. metabolomu • Analýza kvalitativní i kvantitativní

4. Studium přítomnosti proteinů v buňkách (analýza proteomu) • Metody pro stanovení fyzické přítomnosti proteinů: • polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) • westernový přenos • imunoprecipitace • imunohistochemie • izoelektrická fokusace • dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu • chromatografie • fluorescenční a elektronová mikroskopie • průtoková cytometrie

6. Nejpoužívanější techniky - proteiny • Elektroforéza • 1D • 2D • ELISA • Rentgenová krystalografie • NMR • Hmotnostní spektroskopie • Chromatografie (HPLC)

7. SDS-PAGE(= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)-metoda pro separaci proteinů dle jejich velikosti

8. Proč používatakrylamidovýgel kseparaciproteinů? • Akrylamidový gel:pevnáa inertní matrix • Ideálnípro separaci proteinů • Menší velikost pórů než u agarosy • Proteinyjsoumenší než intaktní chromoz. DNA Gel je vytvořen polymerací akrylamidu a N´,N´-methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného.

9. Molekulová hmotnost proteinů • velikostměřenavdaltonech (Da) či kilodaltonech (kDa) • Dalton = jednotka atomové hmotnosti = přibližně se rovná hmotnosti (1,66 x 10 -27 g) • Průměrná aminokyselina = 110 Da • Průměrný nukleotidový pár = 649 Da

10. Akrylamidový gel akrylamid N,N‘ - methylenbisakrylamid

11. Akrylamidový gel Zdroj volných radikálů APS amonium persulfát (NH4)2S2O8 (peroxodisíran amonný) CAS 7727-54-0 Katalyzátor TEMED N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiamin CAS 110-18-9

12. Akrylamidový gel

13. CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 O O S O - O SDS-PolyacrylamideGel Electrophoresis (SDS-PAGE) • SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový detergent • solubilizuje a denaturuje proteiny • dodává proteinům negativnínáboj • Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu • Zvýšená teplota denaturuje proteiny SDS

14. -proteiny jsou tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura -denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisípouze na jejich molekulové hmotnosti

15. Separace proteinů v akrylamidovém gelu

16. Příprava gelu

17. Jednotlivé kroky experimentu*Příprava polyakrylamidových gelů*Příprava vzorků pro SDS-PAGE*Povaření vzorků při 95C po dobu4min.*Aplikace vzorků na gel*Vlastní elektroforesa probíhá při konstantním napětí *Barvení gelu pomocí Coomassie Blue vs blotting *Odbarvení gelu MetOH/HOAc

18. Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE?*Trispufr utváří vhodné pH*DTT (100mM)*SDS (dodecyl sulfát sodný)detergent poskytující proteinům negativní náboj*Glycerolvzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení *“Bromophenol Blue“barvivo umožňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu)

19. Praktické zhotovení gelu • Připravíme ELFO skla • Složíme elektroforetické komůrky pro nalití gelů • Připravíme základní roztok pro dělicí gel, přidáme k němu TEMED a APS pro zahájení polymerace • Naneseme gel do elektroforetické komůrky, zarovnáme hladinu redestilovanou vodou a necháme tuhnout (min. 45 min). • Připravíme roztok pro zaostřovací gel, přidáme k němu TEMED a APS • Nanášíme jej do elfo komůrky na povrch dělicího gelu a vsadíme hřeben pro vytvoření jamek a necháme jej tuhnout (min. 45 min) • Odstraníme hřeben, uvolníme elfo komůrky s gelem

20. Do elektroforetické nádoby nalejeme elfo pufr • Stojan s elfo komůrkami s připravenými gely vložíme do elfo nádoby, doplníme elektroforetický pufr • Naneseme vzorky (před nanášením se musí povařit se vzorkovým pufrem při 90-100C po dobu 5 min) • Doplníme elfo pufr a zapneme zdroj (80V po 0,5-1hod, 120 V po 1-1,5 hod) • Ukončení elektroforézy po doběhnutí elfo barviva na konec dělicího gelu • Rozděláme elfo komůrky, vyndáme gely a: - barvíme - přeneseme proteiny na nitrocelulózovou membránu a blotujeme…

21. SDS-PAGE standardy Protein Kalibrované MW v Tris-HCl gelu • Myosin 201,179 • -galactosidáza 120,284 • Bovinní sérový albumin 100,236 • Ovalbumin 55,925 • Anhydráza 38,289 • Soyben trypsin inhibitor 29,678 • Lysozym 20,669 • Aprotinin 6,969

22. Denaturované vzorky jsou naneseny na gel

23. Podmínky pro elektroforézu: • 15 min, 100 V • 1 – 1,5 hod 150 V

24. Princip dělení, Laemliho pufrový systém Různé pH „stacking“ a „resolving“ gelu Tris-Cl pufr, glycinový running pufr

25. Iontové složky Laemliho systému Glycin → nižší pohyblivost než Cl- ionty Ohmův zákon V=I*R Stejné I → ↑ V ↑ odpor v Gly oblasti SDS-proteiny - mobilita mezi Gly - Cl-, „chyceny“ a zaostřovány v tenké oblasti gradientu el. napětí

26. Iontové složky Laemliho systému glycin Zvýšení mobility Gly iontů v pufru o vyšším pH Pohybují se před komplexy SDS-protein Snížení mobility proteinů v důsledku vstupu do koncentrovanějšího gelu Dělení proteinů na základě jejich velikosti (molekulární hmotnosti)

28. Nativní PAGE Blue Native (BN)-PAGE - využívá Coomassie blue → negativní náboj, nedenaturační Clear Native (CN)-PAGE - nedenaturační, dělení proteinů na základě náboje, velikosti a konformace → kombinace různých pufrů a gelů Spojení BN a SDS-PAGE - analýza komplexů Acidický Erytropoetin vystaven působení vyšší teploty → dimerizace

29. K vizualizaci proteinů dochází v roztoku Coomasie blue.

31. Barvení stříbrem 75 kDa 50 kDa 37 kDa 25 kDa 20 kDa 15 kDa 10 kDa Redukující PLB (5% merkaptoethanol), 3 µl vzorku s pufrem 1:1 15 % gel, 150V, 57 min, Marker – BioRad #161-0374, dual color, 1 µl,