CULTIVO IN VITRO DE VEGETALES EN BIOFABRICAS

1. CULTIVO IN VITRO DE VEGETALESEN BIOFABRICAS

2. Cultivo de tejidos • Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas (explantos) en un medio de cultivo apropiado • El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia controlados. • La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar • Esta técnica es importante en la propagación de especies de interés agroforestal y agrícola: micropropagación

3. Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria, como alcaloides, compuestos aromáticos o pigmentos. • Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de producción.

4. Cultivo in vitro

5. Plasticidad Totipotencialidad Es la capacidad de una célula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa. Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado.

6. Cultivo de células vegetales Definición • Cultivo aséptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo. • Tipos de cultivos: • cultivo de células • cultivo de tejidos • cultivos de órganos

8. Cultivos vegetales • Cultivos agronómicos • Cultivos in vitro • Cultivos diferenciados ( raíces, tallos, embriones, raíces y tallos transformados) • Cultivos indiferenciados ( callos, suspensiones)

9. Cultivos indiferenciados • Callos : en medio sólido, crecimiento lento, gran heterogeneidad celular, • Cultivos en suspensión: derivan de los anteriores, en medio líquido de composición adecuada, crecimiento más rápido y homogéneo. • Composición del medio de cultivo. Fuente de carbono, minerales, vitaminas, fitohormonas (auxinas, citoquininas)

10. Callos • Tejidos no diferenciados ( a veces diferenciados), en división activa. • Frecuentemente se desarrollan a partir de heridas.

11. Medio de cultivo • Mezcla de sustancias en los que las células, tejidos y órganos pueden dividirse y crecer. • Sustancias inorgánicas: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na • Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I • Suplementos orgánicos complejos: leche de coco, extracto de levadura. • Reguladores de crecimiento : hormonas. • Fuente de carbono: sacarosa • Con o sin agar: medio semi -sólido o líquido.

12. Hormonas/ Fitohormonas: Auxinas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen la elongación, o en algunos casos la división celular. Frecuentemente inducen raíces adventicias e inhiben la formación de tallos adventicios. Cytokininas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen división celular y frecuentemente tallos adventicios y en muchos casos inhiben la formación de raíces adventicias. Reglas generales para la acción hormonal: • Auxina : Cytokinina = ~1 Callo • Auxina : Cytokinina < 1 Tallo • Auxina : Cytokinina > 1 Raíces Son producidos por microorganismos Reguladores de crecimiento

13. Terminología y técnicas • 1. Explanto: porción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo. • 2. Esterilización: procedimiento para la eliminación de microorganismos. • Autoclave: aparato en el que el medio, material d vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presión (121oC, 15 psi, 10-20 min.). • Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos. • Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire estéril.

14. Subcultivo: pasaje de células, tejidos, órganos, etc. Desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco. • Micropropagación: propagación vegetativa in vitro de plantas.

15. Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo órganos (raíces, tallos) o embriones. Adventicios: desarrollo de órganos (raíces, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-like structures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos.

16. Formación de tallos, raíces, flores, etc. ¡¡Regeneración de una planta completa!! Organogénesis (formación de órganos) Explanto Organogénesis Formación de tallos Formación de raíces Enraizamiento Tallos Planta completa

22. Embriogénesis (formación de embriones) Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una célula huevo fertilizada o asexualmente desde un grupo de células somáticas (embriogénesis somática).

23. Embriogénesis Somática • Procedimiento para la regeneración vía embriogénesis somática • 1. Iniciación: callos embriogénicos • 2. Proliferación: callos embriogénicos, masas proembriogénicas (PEM) • 3. Desarrollo y maduración de embriones : embriones • 4. Germinación de embriones (Regeneración) • Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas: • Masas proembriogénicas • Estadío globular • Torpedo • Embrión somático

26. Semillas artificiales • Semillas sintéticas (artificiales) • 1. Producción en masa de semillas genéticamente mejoradas. • 2. Procedimientos: • Encapsular en cápsulas de gel, recubrir con una cubierta adecuada, almacenar • 3. Encapsulación de embriones somáticos: protección, nutrición, permeable al agua, biodegradable. • Polímeros: gel de alginato, gelatina, agar, goma, etc.

27. Variación Somaclonal • Variación fenotípica, genética o epigenética en su origen. • Permite describir la variabilidad genética observada en tejidos regenerados a partir de cultivos in vitro • Es común cuando se regeneran plantas a partir de callos, o cuando los cultivos se establecen a partir de explantos que no contienen un meristema pre-organizado. • En muchos casos, el grado de variación es proporcional a la duración del cultivo in vitro. • Se aplica para mejora de cultivos

28. Aislamiento de protoplastos • Protoplasto: célula vegetal sin pared celular • Procedimiento: • (1). Digestión de la pared celular: celulasa, hemicelulasa, pectinasa. Son producidos por microorganismos. • (2). Regeneración de la pared celular: usualmente dentro de las 24 hrs. • (3). División celular: la primera división ocurre dentro de las 24-48 hrs • (4). Proliferación y diferenciación

29. Protoplastos

30. Aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos • Aplicaciones: • 1. Remoción de pared para captación de DNA : Microinyección y electroporación • 2. estudios de síntesis de pared celular, transporte de membrana, citoesqueleto. • 3. estudio de desarrollo de embriones somáticos. • 4. hibridización somática (cybridización) de especies sexualmente compatibles o incompatibles, por fusión de protoplastos se obtiene un nuevo germplasma.

33. Aplicaciones • 1. Mantenimiento del background genético deseado: micropropagación. • 2. Producción en gran escala de cultivares apropiados: embriogénesis somática • 3. Síntesis de productos usando técnicas de cultivo continuo. • 4. Eliminación de virus y otros patógenos. • 5. Regeneración de plantas obtenidas por ingeniería genética.

34. Cultivos diferenciados • Raíces y tallos transformados: obtenidas por transformación genética con la bacteria patógena del suelo Agrobacterium sp. • Se pueden usar para la producción de metabolitos derivados de raíces, crecimiento rápido, mayor estabilidad genética, mayor productividad.

35. Tecnología del ADN recombinante • El uso de la biotecnología moderna implica, inicialmente, el conocimiento y aislamiento de secuencias de ADN que corresponden a genes responsables de conferir una característica deseada (fenotipo) • El aislamiento de los genes de interés es realizado por medio de técnicas de clonado molecular

36. Clonado molecular • Inducción de la amplificación de una secuencia de ADN en un organismo vivo. • Vectores de clonado (plásmidos o virus): vectores en los que la secuencia de ADN es introducida usando una DNA ligasa. Cuando es necesario el fragmento de ADN de interés puede ser liberado del vector por medio de enzimas de restricción. • Una vez aislados los genes de interés son incorporados al organismo blanco resultando en un organismo genéticamente modificado (OGM) y esta característica adquirida pasa a ser hereditaria

37. Es posible transferir genes de animales, bacterias o virus a las plantas. Se amplían los recursos para el mejoramiento genético. Los genes de un organismo que son insertados en otro se denominan transgenes y tienen la capacidad de conferirle a este último una determinada característica.

38. Organismos transgénicos • Son excelentes modelos para el estudio de procesos generales básicos como regulación de la expresión génica y la genética molecular del desarrollo y diferenciación celular • Ofrecen la posibilidad de corrección de numerosas enfermedades hereditarias: terapia génica

39. Organismos transgénicos • Pueden funcionar como bioreactores para la producción de proteínas valiosas o con propósitos industriales • Deben ser capaces de producir la proteína de interés en niveles aceptables sin comprometer el normal funcionamiento de sus células • Deben tener la capacidad de transmitir esta característica a las siguientes generaciones • En el caso de ser un organismo multicelular deben ser capaces de producir la proteína exógena en un órgano definido

40. Estrategia actual • Acoplar a la secuencia de ADN que codifica para la proteína de interés secuencias de ADN que contengan señales responsables de dirigir altos niveles de producción (promotor) de la proteína deseada en un órgano específico. • Las técnicas para la inserción de ADN en células vegetales (transformación) usadas son: • Infección con Agrobacterium tumefaciens • Electroporación de protoplastos • Método biolístico

41. Avances • Los primeros experimentos a campo con plantas transgénicas se realizaron en 1986 en Estados Unidos y en Francia. • En 1996 y 1997 el número de países que ensayó plantas transgénicas a campo aumentó a 45 habiéndose realizado en 2 años mas de 10 mil experimentos. • Los cultivos más usados fueron: maíz, tomate, soja, batata, algodón, canola. • Las características genéticas introducidas son tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos, calidad de producto y resistencia a virus.

42. Clonado de plantas • La técnica del clonado in vitro es posible mediante el cultivo de tejidos • Esta técnica se basa en la totipotencialidad de las células vegetales, por medio de la regeneración in vitro, vía organogénesis o embriogénesis somática

43. Transformación • Se producen cambios por inserción de un gen proveniente de otro organismo • La transferencia de DNA/genes de un organismo a otro se realiza sin necesidad de reproducción sexual. • La transformación exitosa depende de la incorporación estable del gen nuevo en el genoma de la planta receptora y su subsiguiente transmisión a sucesivas generaciones.

44. Transformación Requerimientos • Mecanismo de transferencia del gen • Mecanismos de transferencia indirecta • Mecanismos de transferencia directa • Sistemas de regeneración

45. Transformación indirecta Mediada por Agrobacterium: • Agrobacterium es una bacteria patógena del suelo para dicotiledóneas y algunas coníferas. • • Agrobacterium tumefaciens – crown gall disease (tumors) • • Agrobacterium rhizogenes – hairy root disease (hairy roots) • Las Monocotiledóneas presentan resistencia natural a Agrobacterium.

46. Transformación • Agrobacterium tumefaciens & crown gall disease • Crown gall disease produce nódulos anormales en raíces. Los árboles jóvenes no crecen, en los árboles adultos la corteza se pudre. • Esta bacteria entra al árbol a través de heridas.

48. Transformación Agrobacterium tumefaciens • La enfermedad crown gall resulta de la expresión de genes codificados por un segmento de DNA de la bacteria que se transfiere e integra en forma estable al genoma vegetal • El fragmento de DNA bacteriano contiene genes que producen hormonas cuando se expresan en las células vegetales ocasionando divisiones y crecimiento anormales (tumores). • Agrobacterium es un “ingeniero genético natural”(1983). • Es un mecanismo de transferencia entre reinos

49. Transformación Transformación mediada por Agrobacterium • Plásmido Ti: plásmido inductor de tumores (A. tumefaciens) • Plásmido Ri: plásmido inductor de hairy roots (A. rhizogenes) • T-DNA: DNA que se transfiere • genes para síntesis de hormonas:codifican para enzimas involucradas en la biosíntesis de auxinas y citoquinias. La expresión de estos genes en la célula vegetal causa la enfermedad de agalla de corona o la formación de hairy roots • Secuencias en los bordes: 25 bp direct repeats, borde derecho (RB) y borde izquierdo (LB),a ambos lados del T-DNA. Son los elementos necesarios (en la región del T-DNA ) para dirigir la transferencia del T-DNA.

50. Transformación mediada por Agrobacterium PlásmidoTi o plásmidoRi: • Genes de síntesis de opinas: responsables de la síntesis de nuevas opinas. • Opinas: derivados de aminoácidos o azúcares producidos por tejidos vegetales infectados que son por Agrobacterium como única fuente de carbono/nitrógeno. Clasificación de los plásmidos Ti y Ri: Plásmidos Ti: plásmidos Nopalina • Octopine plasmid • Agropine plasmid • Succimanopine plasmid Plásmidos Ri: plásmidos Manopina • Agropine plasmid • Cucumopine plasmid