Enzymová aktivita

1. E + S ES E + P Enzymová aktivita Kinetika podle Michaelise a Mentenové Jednotky enzymové aktivity KATAL (kat) 1 katal = 1 mol přeměnéného substrátu (event. vzniklého produktu) / s MEZINÁRODNÍ JEDNOTKA (IU, international unit) 1 IU = 1 mol přeměněného substrátu (event. vzniklého produktu) Vlim Specifická aktivita Aktivita vztažená na jednotkovou hmotnost proteinu (typicky 1 mg) Používá se k charakterizaci čistoty enzymového preparátu Enzymová aktivita se obvykle stanovuje za optimálních podmínek (teplota, pH, atd.) při nasycení enzymu substrátem (S  Km). Za takovýchto podmínek odpovídá aktivita limitní rychlosti (a = Vlim)

2. Metody homogenizace pletiv Pro každou aplikaci je třeba vybrat vhodnou metodiku v závislosti na vlastnostech izolovaných objektů či látek Třecí miska + nejdostupnější metoda homogenizace + vhodná pro velké množství typů homogenizovaných materiálů + lze použít kapalní dusík pro zvýšení efektivity homogenizace - pomalé a fyzicky náročné zpracování vzorku Ultraturax + rychlé zpracování velkého množství vzorků, snadné chlazení Mixer + velké množství zpracovaného materiálu - málo citlivá metodika Pístový homogenizátor + velmi citlivá metoda - obtížne zpracování velkého množství vzorků Ultrazvuk + rychlé zpracování velkého množství vzorků, snadné chlazení - možnost vzniku artefaktů díky mechanickému poškození molekul • Enzymová lýze + osmotický šok • + velmi citlivá metodika • časově náročné, mohou vznikat artefakty Mrazový lis + zpracování velkého množství mikrobiální biomasy - časově náročná metodika Balotina + velmi citlivá metoda homogenizace mikroorganizmů - časově náročná metodika

3. Extrakční pufr Pro každou aplikaci je třeba vybrat vhodný pufr v závislosti na vlastnostech izolovaných objektů či látek Pufrační systém Nastavení a stabilitace vhodného pH Tris, fosfát, fyziologické pufry (PIPES, MES, atd.) Adsorpční činidla Odtranění produktů degradace polyfenolů a barviv PVP (polyvynylpyrrolidon) Osmotikum Vyrovnání osmotického tlaku při izolaci organel sacharosa, manitol Extrakční pufr Antioxidanty Ochrana před nežádoucím působením oxidantů (aktivní kyslík atd.) DTT (dithiotreitol), merkaptoethanol Anorganické ionty Stability některých látek nebo enzymů je závislá na přítomnosti určitých anoganických iontů Ca2+, K+, Mg2+ Inhibitory proteas Ochrana extrahovaných proteinů před nežádoucí degradací PMSF (fenylmethyl sulfonyflfluorid), EDTA, leupeptin, komerční koktejly inhibitorů

4. úhlový rotor křížový rotor centrifugace supernatant pelet Centrifugace otáčky (Rounds Per Minute) Přetížení (Relative Centrifugation Force ) 200  g jádra 1000  g chloroplasty Hrubě přefiltrovaný extrakt mitochondrie 10 000  g 100 000  g ribosomy

5. Enzym katalyzující detekční reakci Enzym katalyzující preanalytickou reakci Esterasa Stanovovaný enzym Detekovatelný produkt Substrát2 Produkt Substrát1 Preanalytická reakce Analytická reakce Detekční reakce Stanovení enzymové aktivity Pro účely stanovení enzymu se obvykle sleduje přírustek koncentrace produktu enzymové reakce v čase. Stanovení se obvykle provádí za optimálních podmínek (teplota, pH, iontová síla) při nasycení enzymu substrátem. Obecné schéma stanovení enzymové aktivity fotometrie titrační stanovení fluorimetrie elektroanalytické metody hmotnostní spektroskopie fluorescein (fluorimetrie) fluoresceindiacetát Analytická reakce automatizace stanovení

6. Excitovaný stav Nezářivý přechod Excitace Emise Základní stav Fluorescence fluorescein a b Fluorescence (FRU) lexcitation (nm) lemmision (nm)

7. Fluorimetrie Kyveta se vzorkem Schema fluorimetru Monochromátor Štěrbina Fotonásobič Štěrbina Pro zředěné roztoky (absorbance < 0,05) platí: Fluorescence = k  koncentrace Monochromátor Kde k je konstanta pro daný fluorimetr. Fluorescence závisí na: teplotě a polaritě prostředí Zdroj světla • Fluorimetrické měření ruší: • zákal • přítomnost silně absorbujících látek • detergenty