Vanád a experimentálny diabetes mellitus

1. Vanád a experimentálnydiabetes mellitus František Ništiar Inauguračná prednáška UVL Košice, 10. júna 2004

2. Dejiny vanádu a diabetes • 1813 - Del Rio mineralóg objavil (panchrómium) • 1822 – Nils Sefström pomenoval vanád • 1875 – Priestly v Anglicku študuje fyziológiu vanádu • 1899 – Lyonnet vo Francúzku využíva vanád v terapii diabetes • 1954-59 – Curran a Lewis vanád znižuje cholesterol • 1974 – Cantley inhibuje Na,K-ATPázu

3. Dejiny vanádu a diabetes • 1980 – Karlish a Kleinzeller uľahčuje transport glukózy do tukových buniek • 1985 – McNeill orálne podanie STZ-diabetickým potkanom zmierňuje príznaky diabetes • 1986 – Robson objav V-dependentnej nitrogenázy u baktérií • 1995 – Boden, Cohen, Kahn, Goldfine klinické štúdiá u ľudí so soľami vanádu

4. Vanád v živých organizmoch • v krvinkách zástupcov podkmeňa Tunicata • v peroxidázach morských rias • v nitrogenázach rodu Azobacter • v tkanivách cicavcov(Morinville et al., 1998) • v tele človeka 100-200 mg (Byrne a Costa, 1993) • denný prívod je menší ako 50 mg (Nielson, 1995) • na vyvolanie inzulínmimetického účinku viac (100-120 mg)

5. Vanadium – na počesť bohyne Vanadis(Waters, 1977; Shaver a spol., 1995) • Oxidačné stupne: -3, -1, 0, +1, +2, +3, +4, +5 • Izotopy: 23V4623V4723V4823V4923V5023V5223V5323V5423V51 • Kovový vanád sa v prírode nevyskytuje • V zemskej kôre 150 mg.kg-1 (0,02%) • 65 minerálov (karnatit, vanadinit) • V oceánoch po Mo druhý (30-50 nmol/l)

6. Esenciálny stopový prvok Inzulínmimetický účinok Vývoj a delenie buniek Súčasť enzýmov Väčšina sa neresorbuje (98-99,9 %) Vylučuje sa s féces 0,1-2 % transformovaných v žalúdku na VO2+ a absorb. v duodéne Vanadičnan V5+ ako VO3- v plazme a ECT Vanadičitan V4+ ako VO2+ v plazme a ICT Depot – kostná dreň V tkanivách málo V sére menej ako 1-2 mg/l Čo vieme o vanáde? terapeuticky 100-120 mg pro toto et pro die

7. Absorpcia a distribúcia vanádu kosti Orálny V ostatné tkanivá Rôzne straty (koža, vlasy) GI trakt RBC • Cirkulácia GSH Neabsorbovaný vanád Absorbovaný vanád obličky pečeň sekrécia žlčou moč féces Prebraté od Sandström et al. Nutr. Res. Rev. 1993

8. Apo-transferín (Apo-tf) 2 Fe(III) väzobné miesto Viaže 2 VO2+ Vyžaduje: synergistický väzobný anión Fe len na 30% saturované v obehu Apo-tf = 25 µmol Sérový albumín (Alb) Viacero väzobných miest Scavenger (lapač) kovov Nešpecificky môže viazať až 5 VO2+ Zapojený do transportu mnohých látok Alb = 600 µmol Transport vanadičitanu v cirkulácii (dva proteíny)

9. Klasifikácia vanadičnanov (V5+): ich názvy, vzorce, príprava a kinetická stabilita

10. Toxicita zlúčenín vanádu • Akútna a chronická • Najtoxickejší je V2O5 potom V2O3 a VO2 • VOSO4 je toxický pri parenterálnej aplikácii 35-45 mg.kg-1 u R • NH4VO3 1-2 mg.kg-1 • NaVO3 30-40 mg.kg-1 perspektíva bis(maltolát)oxovanadičitan (BMOV)

11. Bis(ligand)oxovanadičitanové komplexy Prof. P. Schwendt, PrF UK V. G. Yuen et al. J. Inorg. Biochem.1997, 68, 109 M. Melchior et al. Inorg. Chem.1999, 38, 2288 K. H. Thompson et al. J. Biol. Inorg. Chem.2003, 8, 66

12. Biologické účinky zlúčenín vanádu • Vplyv na metabolizmus sacharidov • transport glukózy • translokácia glukózových transportérov • glykolýza a glykolytické enzýmy • oxidácia glukózy • syntéza glykogénu • Vplyv na metabolizmus tukov • Vplyv na metabolizmus bielkovín • Vplyv na mitogenézu Apoptóza

13. In vitro účinky vanádu na signálnu dráhu inzulínu • Stimuluje autofosforyláciu InsR • Zvyšuje tyrozínkinázovú aktivitu InsR • Zvyšuje väzbovosť InsR • Zvyšuje aktivitu tyrozínových proteinkináz • Zvyšuje aktivitu Ser/Thr proteinkináz • Inhibuje aktivitu fosfotyrozínových fosfatáz kostimulácia amplifikácia

14. V čom to spočíva? [PO4]3–[VO4]3–

15. S S Inzulín S S S S S S +3HN NH3+ -podjednotka -S-S- EXTRACELULÁR. -OOC - COO +3HN NH3+ Plazmatická membrána CYTOPLAZMA transmembránová doména Tyrozín kinázová doména -OOC COO- -podjednotka Inzulínový receptor. Inzulín sa viaže na -reťazec a prenáša signál cez transmembránovú doménu -reťazca čím aktivuje tyrozínkinázovú doménu

16. 3 2 IRTK (R) fosforylácia/ aktivácia 1 IRTK (L) aktivácia väzba inzulínu OP OP L R Fosforylácia kata-lyzovaná s IRTK (L) Extracelulár. P P P Cytoplazma P P ATPs ADPs Aktivácia tyrozínkinázovej domény inzulínového receptoru naviazaným inzulínom, s následným autofosforylačným reťazcom

17. 3 2 IRTK (R) fosforylovaný/ aktivácia 1 4 IRTK (L) aktivácia IRTK (L) fosforylovaný väzba inzulínu PO OP OP OP PO OP L R ATPs ADPs ATPs ADPs Fosforylácia kata- lyzovaná s IRTK (L) Extracelulár. P P P P P P Cytoplazma Aktivácia tyrozínkinázovej domény inzulínového receptoru naviazaným inzulínom, s následným autofosforylačným reťazcom

18. Glukóza GLUT-4 PO OP Transport glukózy (sval/tuk) PO OP Aktivovaná IRTK Signálna transdukcia (napr., fosforylácia IRS, SHC, PLC) Inhibícia proteín- fosfatáz Defosforylácia: glykogén syntáza KINÁZOVÁ KASKÁDA glykogén fosforyláza (fosforylácia proteínov) Fosforyláza kináza Rast buniek Acetyl-CoA karboxyláza mitogenna a replikácia Extracelulár. hormón-senzitívna lipáza odpoveď Syntéza mRNA fosfofruktokináza-2 pyruvátkináza HMG CoA reduktáza Syntéza DNA Regulačné kinázy Cytoplazma Proteo- syntéza Účinok inzulínu metabolická odpoveď JADRO

19. In vivo účinky vanádu u STZ-diabetických potkanoch

20. In vivo účinky vanádu pri diabetických modeloch

21. Hlavné biologické účinky vanádu • Inhibícia tyrozínových proteínfosfatáz (PTPs) (Bevan a spol., 1995) • Stimulácia MAP kinázy (Hei a spol., 1994) • Aktivácia génov pre PEPCK# a GLUT (Ferber a spol., 1994) # Fosfoenolpyruvát karboxykináza Preto je potencionálne terapeutikum pri liečení diabetes mellitus 1. a 2. typu (Thompson, 1999; Srivastava, 2000) • Vplyv na bunkový cyklus (Foresti a spol., 2001, Ništiar a Rácz, 2003; Rácz a Ništiar, 2003) • Úloha v apoptóze???

22. …ešte raz... [PO4]3–[VO4]3–

23. Moji najbližší spolupracovníci R R R

24. Vplyv vanádu a zinku na vylučovanie glukózy močom u BB potkanov v akútnom pokuse • NH4VO3 1 mmol/l (12 R, 4 mes. 6 M a 6 F) • ZnCl2 1 mmol/l (12 R, 4 mes. 6 M a 6 F) • 2 U inzulínu Interdep (12 R, 4 m. 6 M a 6 F) • 2 U inzulínu Ultralente (12 R, 4 m. 6 M a 6 F) • Diabetické kontroly Všetky potkany kmeňa BB (spontánne diabetickí, do skupín boli zaradený náhodne ak mali glykémiu po 3 dní vyššiu ako 16 mmol/l)

25. Príjem krmiva, vody, hladina glykémie a množstvo vylúčeného moča

26. Koncentrácia glukózy v moči a celkový výdaj glukózy močom, glukózový index a asimilačný koeficient

27. ZÁVERY • Vanád nemal inzulínu podobný účinok • Vanád zvyšoval výdaj glukózy močom • Vanád znižoval asimiláciu glukózy, inzulín zvyšuje • Jeho hypoglykemizujúci účinok zodpovedal zníženému príjmu vody a krmiva (refuse effect) • V naších pokusoch bola denná dávka V okolo 27,5 mg.kg-1 oproti klinickým štú-diám 1,5-1,9 mg.kg-1 • Overiť toxicitu vanádu v akútnom a chronickom experimente

28. Overenie toxicity NH4VO3 u potkanov pri rôznych spôsoboch aplikácie • Overili sa jednorázová p.o. (gavage), s.c., i.p. a i.v. toxicita (n = 24; 12 M a 12 F) • Chronická expozícia v pitnej vode počas 90 dní pri koncentráciách 0,1; 0,5 a 1,0 mmol/l (n = 24 R samce) • Potkany kmeňa Wistar (vlastný chov) • Potkany kmeňa BB (vlastný chov) • Sledovanie vybraných fyziologických a biochemických parametrov

29. LD50 a LD100 pre akútne intoxikácie

30. Overenie chronickej toxicity (90 dní) vanadičnanu v pitnej vode • Skupina 1 – Wistar, čistá voda, 24 R • Skupina 2 – Wistar, 0,1 mmol/l, 24 R • Skupina 3 – Wistar, 0,5 mmol/l, 24 R • Skupina 4 – Wistar, 1,0 mmol/l, 24 R • Skupina 5 – BB, čistá voda, 24 R • Skupina 6 – BB, 0,1 mmol/l, 24 R • Skupina 7 – BB, 0,5 mmol/l, 24 R • Skupina 8 – BB, 1,0 mmol/l, 24 R

31. Výsledky a závery • Pri koncentrácii 1 mmol/l úhyny – dehydratácia a profúzne hnačky, • Pri koncentrácii 1,0 mmol/l a 0,5 mmol/l je denná dávka vanadičnanu 8 resp. 4 násobne vyššia ako pri klinických štúdiách u ľudí • Pri koncentrácii 0,1 mmol/l denná dávka predstavuje približne 1,0 mg.kg-1, čo zodpovedá humánnym aplikáciám okolo 1,5 mg.kg-1 (O´Connell, 2001)

32. Vplyv vanádu na homeostázu glukózy u BB potkanov • 240; 3,5-4 mes. samci BB (120 diabetic.) • 6 skupín (3 nediabetické a 3 diabetické, čistá voda, 0,1 a 0,5 mmol/l vanadičnanu po 90 dní • Sledované parametre: prežívanie, hmotnosť, príjem krmiva a vody, výdaj moča, glykémia, glykozúria, GI a AQ • Studentov t-test a ANOVA

33. Vplyv vanadičnanu na vybrané para-metre diabetických a nediabetických potkanov v chronickom pokuse

34. Vybrané parametre (pokračovanie)

35. Závery • Použitie vanadičnanu v nízkych koncentrá-ciách okolo 0,1 mmol/l má pozitívny vplyv na homeostázu glukózy a nie sú prítomné negatívne vedlajšie účinky vyšších dávok (refuse effect, dehydratácia, hnačky, úhyny) • Predpokladáme kostimuláciu inzulínového receptoru vanádom • Predpokladáme moduláciu amplifikácie signálno-transdukčnej kaskády vanádom

36. Vplyv vanádu na incidenciu výskytu spontánneho diabetu u BB potkanov v multigeneračnom pokuse (inbr.) • 6 párov (F+M) počas generácií F1-F6 so suplementáciou 0,1 mmol/l vanadičnanu a bez suplementácie vanadičnanu • Sledované vybrané parametre: • % prežívania, • priemerná doba života, • počet odchovaných mláďat, • % výskyt diabetických jedincov.

37. Vplyv suplementácie vanadičnanu na vybrané ukazatele u BB potkanov (ND = nediabetické, LS = dĺžka života v dňoch)

38. Vplyv suplementácie vanadičnanu na vybrané ukazovatele u BB potkanov II.

39. Závery • Suplementácia vanádu má významný preventívny účinok na rozvoj diabetes (znižuje počet diabetických jedincov) • Vanád udržuje natalitu a reproduktibilitu počas inbreedingu • Suplementácia vanádom predĺžuje dobu života u BB potkanov • Náchylnosť na diabetes suplementácia vanádom neovplyvnila

40. Kombinovaná aplikácia inzulínu a vanadičnanu v chronickom pokuse 90 dní po 24 potkanov (M) BB v skupine • Diabetické • Inzulín 2 U#, 1xdenne • Inzulín 1 U #, 1xdenne • Vanád 0,1 mmol/l vanadičnan amónny • Inzulín 1 U + 0,1 mmol/l vanadičnan # inzulín Ultralente MC, Novo

41. Príjem krmiva a vody, glykémia a výdaj moča

42. Koncentrácia glukózy v moči a celkový výdaj glukózy močom, glukózový index a asimilačný koeficient

43. Závery • Kombinácia inzulín s vanadičnanom, je porovnateľná, resp. efektívnejšia ako terapia samotným inzulínom • Pri použití kombinácie Inz + V stačí použiť podstatne nižších dávok inzulínu • Potreba jednoznačne objasniť molekulové mechanizmy zodpovedajúce za zistený fenomén

44. Celkové závery • Vanád má preventívny účinok na rozvoj diabetes mellitus u BB potkanov • Vanád má antidiabetický účinok prostredníctvom zníženia glykémie • Vanád zlepšuje ukazovatele reproduktivity • Vanád predĺžuje priemernú dlžku života • Optimálna koncentrácia pre efektívnu suplementáciu je 0,1 mmol/l (tj. 1mg/kg/d) • Kombinácia 0,1 mol/l vanadičnanu s inzulínom, znižuje potrebu inzulínu na polovicu.

45. Hypotetické mechanizmy V zasahuje V zasahuje????? Brichard et al., 1993 McNeill & co-workers, 2001, 2002 Shafrir et al., 2001 Vankatesan et al., 1991 Bevan et al., 1995 V zasahuje V zasahuje????? Tracey & co-workers, 1999, 2000 Fantus & co-workers, 2001 McNeill & co-workers, 2002 Shechter & co-workers, 1997 McNeill & co-workers, 2001 (Modifikované z R. Saltiel a C. R. Kahn, Nature 2001, 414, 799) Vanád podporuje funkciu inzulínu tým, že inhibuje fosfotyrozínové fosfatázy (PTPases), tie potom nemôžu inaktivovať proteínkinázy(ostávajú fosforylované) Vanád stimuluje GLUT4 v kostrových svaloch

46. Bez Vás by to nebolo - ďakujem • UVL LF UPJŠ RODINA KINGA • Tí, ktorí ste už žiaľ odišli: rodičia, Kika, J.Lazar, O.J.Vrtiak • Tí, ktorých menovať nemôžem, lebo ste pre mňa rovnako milí • a moje pokusné objekty

47. Ďakujem za pozornosť Očakávam Vaše otázky