1 / 20

Přenos jader

Přenos částí buněk. Přenos jader. Ne příliš úspěšné, přesto popsány intra- a interdruhové přenosy. 1985 získány důkazy o funkci genů přeneseného jádra. Přenos mikrojader jádra obsahující jen část jaderného materiálu.

liseli
Download Presentation

Přenos jader

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Přenos částí buněk Přenos jader Ne příliš úspěšné, přesto popsány intra- a interdruhové přenosy 1985získány důkazy o funkci genů přeneseného jádra Přenos mikrojaderjádra obsahující jen část jaderného materiálu Získání: synchronizovaná kultura + mitotický jed, který ovlivňuje funkci vřeténka --- neorganizovaný přechod chromozomů do dceřiných buněk – část obsahuje jen např. 1-2 chromozomy Přenos chromozomů Izolace chromozomů - po synchronizaci - nejlépe v metafázi Přímá vazba na protoplasty pomocí fuzogenů (PEG – nízká frekvence přenosu) Mikroinjekce – vyšší frekvence – lepší regenerace při mikroinjekci do celistvých buněk ?? Osud přeneseného chromozomu, doba trvání v cytoplazmě, fáze buněčného cyklu recipientní buňky Přenos chloroplastů 1969 - přenos špenátových chloroplastů do živočišných buněk 1971 – přenos do slepičích vajíček - přežívání, metabolická aktivita, dělení 1973 – komplementace protoplastů – fúze zelených protoplastů a mutantních s nevyvinutými plastidy – zelenání deficientních chloroplastů Přenos mitochondrií přímá vazba nebyla popsána přenos pomocí fúze protoplastů cytoplazmatičtí hybridi - znuvuuspořádání mt DNA – rekombinace

  2. Přenos izolované DNA (direct gene transfer) 1977 mnoho pokusů, chyběl důkaz integrace do recipientního chromozomu Nevýhoda : vyšší frekvence přeorganizování transgenu a vyšší počet kopií Množství způsobů přenosu DNA: • Přenos pomocí působení PEG • Elektroporací • Mikroinjekcí • Mikrobombardováním

  3. Přenos pomocí působení PEG Chemický „helper“ • PEG, Ca 2+ zvyšuje vazbu DNA na povrch protoplastu • Poly L- ornitin – zpomaluje degradaci plazmidové DNA DNázami, stimuluje vazbu (neutralizací povrchového náboje) a expresi DNA v protoplastech • Krystalky fosforečnanu vápenatého- + fuzogen +  pH – endocytóza krystalků Lipozomy- fosfolipidy dispergované ve vodní fázi, podle podmínek a typu fosfolipidu různé uspořádání i náboj. Chrání DNA, nejlepší fosfatidylserin • Elektroporace 250-350 V, ms, 2000 V, µs – narušení buněčné membrány, vytvoření pórů umožňujících vstup DNA do buňky (narušení membrány laserem) - buňky, pletiva, SE

  4. DNA • Mikroinjekce Imobilizace buněk: skelný povrch pokrytý polylyzinem, přidržovací pipeta • lépe mikroinjekce do jádra (karyoplasty) –  degradace • Koncentrace DNA -  vyšší koncentrace  zvýšení frekvence transformace, ale pozor !! koncentrace toxické • Forma DNA – lineární x nadšrobovicové (supercoil): lineární – vyšší frekvence transformace • DNA lze přenášet mikroinjekcí i do mikrospor, celých buněk, semen  lepší přežívání a regenerace

  5. Co ovlivňuje výsledek ? • Frekvence přežití buněk po transformačním působení • Frekvence rekombinace + frekvence exprese • Frekvence regenerace buněk za daných podmínek • Biolistická metoda (particle gun, particle bombardment) (1987) • ostřelování rostlinné buňky projektily: DNA navázaná na inertní kov (wolfram, zlato)

  6. Řešení otázek : • Mechanismu infekce • Vliv na expresi jaderných genů • Interakce mezi různými viry • Rezistence k virům Vektorový přenos DNA • virové vektory • systém Agrobacteria Virové vektory Lze použít k přenosu cizorodé DNA, neintegrující Dochází k rozšíření, zmnožení a expresi vloženého genu. Kromě patogenicity (např. nahrazení genu pro plášťový protein genem X) rekombinantní virus napodobuje svůj přirozený protějšek v ostatních aspektech možnost koexistence mnohočetných genů, je-li zachována schopnost autonomní replikace

  7. Systém Agrobacteria Agrobacterium běžná půdní bakterie Dvouděložné po poranění a infekci – proliferační schopnost --- tvorba dediferencovaného tumorového pletiva nebo modifikovaných kořenů • Agrobacterium tumefaciens – cown gall- halka • Agrobacterium rhizogenes - hairy roots Čeleď Rhizobiaceae – všichni příslušníci ovlivňují morfologii rostlin, ale jen Agrobacterium mění genetickou výbavu rostlinných buněk Izolace tumorových pletiv a přenesení do podmínek in vitro • růst na médiu bez růstových regulátorů • produkce nových látek – opinů a agropinů

  8. 1974objeven plazmid, prokázána souvislost s virulencí • 1977 důkaz vnášení části genetické informace plazmidu do • rostlinného genomu. Dělení podle produkovaných látek na jednotlivé typy:  oktopinový  nopalinový  manopinový  agropinový  agrocinopinový  leucopinový Opiny - deriváty aminokyselin -- zdroj C a N pro bakterie -- konjugace mezi bakteriemi Agropiny - deriváty cukrů -- zdroj C pro bakterie (stabilní, rostlinou nemetabolizovatelné) nejprostudovanější: oktopinový a nopalinový typ (deriváty argininu)

  9. Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid (150-200kb) T-DNA-oblast ohraničená specifickými sekvencemi, přenášená do jádra rostlinné buňky Vir oblast Replikační počátek Konjugativní přenos Katabolizmus opinů T-DNA nopalinový typ T- DNA 1 segment (23kb) oktopinový typ T-DNA 2 segmenty (13,6; 7kb) • T-DNA – nopalinový typ : • geny kontrolující syntézu auxinů • -“- cytokininů • geny ovlivňující rychlost růstu tumorů • geny pro syntézu nopalinů • geny pro syntézu nosičových proteinů T-DNA – oktopinový typ TR - syntéza oktopinů TL - tumorový růst Z infikovaných buněk nelze regenerovat rostlinu

  10. Vir-oblast Funkce nutné pro vystřižení, přenos a integraci T- DNA (vir oblast nopalinového a oktopinového typu mohou komplementovat) Vir-oblastnení přenášena,zahrnuje několik operonů (vir A (1 protein); vir B (11); vir C (2); vir D (4) vir E (2) Vir G (1), (u některých kmenů vir F, vir H, vir J) Ti plazmid Syntéza a transport extracelulárních polysacharidů Vir oblast Psc A E Chv A Chv B D A G C B konstitutivně Fenolická látka Agrobacteriumtumefaciens připojené k rostlinné buňce Poraněná rostlinná buňka

  11. Sled dějů při přenosu T-DNA do rostlinné buňky • Rozpoznání přítomnosti poraněné rostliny, signál: fenolické látky  chemotaxe • Připoutání bakteriální buňky k rostlinné b. - produkty chromozomálních genů (chvB tvorba -1,2 glukanu; chvA– transportní protein – doprava do periplazmatického prostoru, pscA produkce sukcinoglykanu • Vazba signálních molekul na receptorové proteiny (vir A)  změna konformace proteinu vir A aktivace vir G • Produkt genu vir G aktivace genů vir oblasti • Vytvoření zlomu pro uvolnění T-DNA , vir D1,vir D2odvíjení jednovláknové T-DNA vir D1, vir D2, Vir C1 • Vytvoření přenosového komplexu Vir D2 Vir E2 • Přenos komplexu přes bakteriální a rostlinné stěny (geny vir B) • Vnesení T-DNA do buněčného jádra vir D2 , vir E2 • Integrace do jaderné DNA, přenos do náhodných míst rostlinného genomu

  12. Agrobacterium rhizogenes Homologie Ti a Ri plazmidů choroba – „hairy roots“--- zodpovědný Ri plazmid (root inducing) manopinový typ T DNA … jeden segment T-DNA agropinový typ T-DNA …. dva segmenty T-DNA Téměř všechny kmeny A . rhizogenes mají 3 komponenty plazmidu Ri. malý plazmid: geny pro utilizaci opinů; střední plazmid: T-DNA a jiné geny pro utilizaci opinů velký plazmid: kointegrát obou předchozích T-DNA : geny pro syntézu auxinu, + rolB a rol C – interferující s metabolizmem r. hormonů   citlivost k endogenním auxinům. Vnesené geny jsou nejaktivnější v dediferencovaných pletivech, z „hairy roots“ tumorů lze regenerovat rostliny, které jsou ovšem abnormální

  13. T- DNA vnášený gen T- DNA hraniční sekvence T- DNA vnášený gen hraniční sekvence T- DNA binární vektor Ti plazmid zbavený T-DNA klonovací plazmid: replikační počátek T-DNA hraniční sekvence přenášený gen selektovatelný marker Vektorový přenos při transgenozi a) onkogenní b) neonkogenní a) omezené využití, produkce tumorového pletiva u infekce Ti plazmidovou T-DNA nelze regenerovat dospělé rostliny b) nevytváří se tumor – možná regenerace rostliny

  14. Transformační systém • Společná kultivace protoplastů s Agrobacteriem • Infekce listových diskůAgrobacteriem • Infekce rány na rostlině in vivoAgrobacteriem • Ponoření vyvíjejících se květů do bakteriální kultury – selekce semen Přenesení vytvořeného kalusu na médium  odstranění Agrobacteria antibiotikem  růst tkáňové kultury  regenerace Přenos a exprese cizorodé DNA Možný přenos  jakékoli DNA (přeneseny až segmenty o 50kb) ?? Exprese genů - zachování regulátorových sekvencí genů; nutné iniciační a terminační sekvence funkční v rostlinné buňce Nevýhoda: nehodí se pro všechny rostliny a všechna pletiva (přednostně funguje u dvouděložných), jednoděložné výběr vhodného kmene, supervirulentní kmeny s více kopiemi některých Vir genů. Možnost vytvoření stabilních mutantů – využití ke šlechtění rostlin • Stabilita genů T-DNA: • přenosné přes meiosi • exprese genů se postupně snižuje - specifická vlastnost, která se projevuje jen při zachování • T- DNA ( X transgenoze) • zjištěna závislost mezi metylací a potlačením exprese

  15. Budoucnost a rizika ? Biotechnologie a životní prostředí • Využití technik biotechnologie rostlin • pro rozvoj znalostí fyziologie rostlin • k praktickému využití • Množení rostlin Komerčně významné rostliny ? Genetická uniformita Ohrožené rostliny • Ozdravování rostlin ? Somaklonální variabilita • Produkce sekundárních metabolitů, biotransformace • Mutageneze in vitro ? Genetická uniformita ? Somaklonální variabilita

  16. ? Biotechnologie a životní prostředí ? Transgenní rostliny a životní prostředí Je snaha vnášet znaky související s • rezistencí k chorobám (k virům (pouzdrové proteiny); bakteriím; houbám) • 2. rezistencí k parazitům (geny pro toxiny působící na škůdce, Bacillus thuringiensis) • 3. rezistencí k herbicidům (modifikovaný cílový protein; nadprodukce cílového proteinu; detoxifikace herbicidu) • 4. rezistencí k chladu, osmotickému stresu etc. (změny v obsahu osmoticky aktivních látek, stresových proteinů…) • 5. zlepšením kvality produktů (změny v zastoupení a obsahu zásobních látek) • 6. produkcí látek (farmaka, protilátky, vakcíny, technické látky, „molecular farming“)

  17. Rizika využívání transgenních rostlin Nebezpečí 1:transgenní rostlina se stává nekontrolovatelným plevelem (díky ovlivnění schopnosti přežití) GMOin USA typy rostlin : na lidech závislé lidmi dobře kontrolovatelné na lidech nezávislé Nebezpečí 2:přenos genu na divoké příbuzné rostliny možnost křížení překryv kvetení výskyt divokých příbuzných v dané lokalitě Nebezpečí 3:přenos genu na nepříbuzné rostliny (? viry, Agrobacterium) Nebezpečí 4:zvýšení používání herbicidů

  18. Nebezpečí 5:hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky) Nebezpečí 6:ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem Nebezpečí 7:porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru ! Hodnocení každého jednotlivého případu zvlášť ! Nutnost • pečlivého výběru genu i recipientní rostliny • testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky) • sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření

  19. Nebezpečí 5:hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky) Nebezpečí 6:ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem Nebezpečí 7:porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru ! Hodnocení každého jednotlivého případu zvlášť ! Nutnost • pečlivého výběru genu i recipientní rostliny • testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky) • sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření

  20. Díky za pozornost

More Related