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HPLC 教學簡報

HPLC 教學簡報. 銘傳大學 生物科技學系. 學生 : 陳博文 製 96 年 2 月 3 日. 前言. 此乃由使用 HPLC 同學因需要而製作的教學簡報 , 僅供參考使用 , 不足的部分也請自行參照使用手冊或書籍 , 其中一定有不少遺漏或錯誤 , 敬請改正指教 , 此外要有教師指導後使用 , 避免因錯誤觀念而誤導 . 第 0 章 何為 HPLC. A. HPLC 包含幾個重要部份

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HPLC 教學簡報

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Presentation Transcript

  1. HPLC教學簡報 銘傳大學 生物科技學系 學生:陳博文製96年2月3日

  2. 前言 • 此乃由使用HPLC同學因需要而製作的教學簡報,僅供參考使用,不足的部分也請自行參照使用手冊或書籍,其中一定有不少遺漏或錯誤,敬請改正指教,此外要有教師指導後使用,避免因錯誤觀念而誤導.

  3. 第0章何為HPLC A.HPLC包含幾個重要部份 • HPLC,HighPressureLiquidChromatography,高壓液相層析儀,在分析技術中應用廣泛的一種層析法,而層析又以動相和靜相來作為物質分離的依據.(圖一) • 動相:指帶動分析物移動的solvent,又稱流動相,在高壓幫浦推動下,高速流經column,混合液中不同分子,與填充物親和力有差異,故被分離. • 靜相:固定填充於圓柱體(column)內之物質,依需要而填充不同材質,且有不同直徑長度,選用正確column在分析前是重要的.(圖二) • 偵測器:依分析物不同有各式的偵測器,本實驗室目前有DAD,RI 螢光三種detector.(圖三)

  4. 第0章 何為HPLC B.分析移動流程 1.Solvent(流動相) 8.分析報告 6-1.純化收集 6-2廢液回收 2.Degasys(除氣泡) 7.接受資料 3.Pump(加壓) 5.Detector 3-1.Inject (sample注入) 4.Column(分離層析)

  5. 第1章 儀器及溶液配置 • 了解solvent的製備 • 簡介各儀器的使用及注意事項 • 不足的部分請自行參照

  6. 第1節 Solvent配製 A.注意事項 1.Solvent的選擇其試藥的等級要為LC級才可 2.取用藥品要注意先向上級報備,核可後才可使用 3.不論配置何種solvent都必須過濾( ),超音波震盪 4.要注意solvent的pH值,是否column可以耐受 5.Solvent每日要除氣泡,若一段時間不用要保存 6.未能詳述的部分請參照 “Solvent配置流程”

  7. 第1節 Solvent配製 B.以phosphate buffer為例 1.確認所要濃度(50mM),體積(1000mL),及pH值(2.14) 2.取NaH2PO4,H3PO4 來進行調配 3.計算50mM要取多少g來配置NaH2PO4,H3PO4溶液 4.利用 計算NaH2PO4,H3PO4調和體積 5.所配製好的phosphate buffer再和methanol以比例 調成所要的A,B兩種solvent 6.未能詳述的部分請參照” Buffer的配置” A(80%,20%) B(20%,80%)

  8. 第1節 Solvent配製 C. Solvent配製流程 1.計算所要用的藥品 4.抽氣過濾(0.45µm) 2.配製solvent 5.超音波震盪(除氣泡) 3.混合成所要的比例 現用 非現用 6-1.架設於HPLC 6-2.標示保存

  9. 第2節 Pump介紹 A. Pump設置(常用) 從pump面板上,可以設置 1.A,B,C,D四種solvent的比例,總和為100% 2.Pump流速(mL/min) 3.Pump , purge開關 B. 注意事項 1.使用前,先旋開閥,按下purge鍵,把所要用的solvent快速拉到pump中,並注 意氣泡,若無氣泡可停止purge,並將閥旋上.(purge時間不可過長) 2.氣泡不可流入,否則column會受損 3.隨時注意pump的壓力並紀錄 4.儀器必須要condition,若為新的solvent,最少要2個小時

  10. 第3節 Column A. Column簡介 本實驗的column採用Thermo製的Hypersil GOLD 型C18 ,其管柱 為250x4.6mm , 流量為1.25mL/min , 其可耐受的pH範圍1~14(建 意為2~8) , 為reversed phase column ,可抓取非極性物質,越高的 非極性可留置比較久,藉此分離物質. B.注意事項 1.Column的選擇和溫度很重要,請選用正確的column和溫度做分析 2.Column不可以有氣泡進入,否則會受損,且要注意安裝方向 3.要注意solvent的種類和pH值是否column可承受 4.Column前方有一個pre-column,為保護column,隨column而不同 5.Column長時間不用時要保存,如本column使用methanol柱滿封存 6.未能詳述的部分請參照”HPLC分析管柱維護 使用手則”

  11. 第4節 Detector-DAD A.簡介 本實驗所用的偵測器為DAD (Diode array detector) , 是可掃描波長 190-850nm , 為偵測器中常見的種類 ,光二極體陣列偵測器(diode array detector)波長是設定範圍的方式,適合用於開發新成分或是 未知條件時使用,並且可以做圖譜比對,純度測試,因此Data可信度 比UV偵測器高,缺點就是相對於UV偵測器高波長準確度較差,感度較 差.光學結構方面當光線從光源出來後就先直接經過樣品然後才經 過分光鏡分光最後在二極體陣列上各點負責的波長位置去偵測各個 波長的光被吸收掉多少以產生數據. B.注意事項 1.使用前再行打開(要暖機30min以上) 2.D2燈是有壽命的且易損耗,不用時要關閉

  12. 圖六DAD 1.電源及指示燈 (D2&W鎢絲燈) 2.型號

  13. 第7節 Injector A.先以針注入sample(未進column) B.轉動開關至inject注入sample(進入column)

  14. 圖七Injector

  15. 第7節 Injector C.注意事項 1.若未使用,其要保持在inject,且蓋上蓋子避免污染 2.注射針要用HPLC專用的平口針頭 3.Sample注射前要過濾(0.45µm filter) 4.每注射一次,要進行洗針 5.注射量最多為20ul,多餘的會被排出

  16. 第2章 軟體操作 以Resveratrol做範例分析 • Resveratrol為本實驗室的分析物之一 , 其功效可以防老化,抗癌,抗氧化,去自由基,抗發炎等……相當多的好處 • 分析其含量在本實驗室的產品桑椹紅酒中,是目前的課題 • 藉此製作HPLC教學範例使分析工作有範本 • 聲明本實驗條件皆為Resveratrol做分析 • 不足或有其他需要部分請參照益弘儀器的HPLC說明書

  17. 第0節 軟體開啟 1.請點選桌面上的 按鍵 2.進入到以下視窗

  18. 第0節 軟體開啟 3.點選DAD open Open為有和儀器連結 Open-off為離線下的操作

  19. 第0節 軟體開啟 4.進入以下畫面 2.儀器設定精靈 1.顯示儀器狀態

  20. 第1節method設置 1.點選method 1.點擊此 3.積分參數設定 2.此為設置檢量線所用

  21. 第1節method設定 1.壓力界限 2.進入以下畫面-A Pump 2.設置solvent的名稱 3.可調控各時間其 solvent的比例流速 4.Solvent比例組態 (本實驗為等梯度)

  22. 第1節method設定 3.DAD的設定 1.分析的時間及取樣時間 2.偵測的波長範圍 3.檔案大小(太大無法記憶)

  23. 第1節method設定 3.PDA Options設定(畫檢量線時必須) 設定所要積分的波長(如310nm)

  24. 第2節sequence設定 1.點擊File中sequence 可新建或開啟 舊有的sequence

  25. 第2節sequence設定 2.設定細項 5.分析後檔案名 (注意不要蓋檔) 1.Sequence狀態 4.分析時所用method 務必相同(做檢量線) 2.Level(標準品濃度定義) 3.樣品重複次數

  26. 第2節sequence設定 3.分析開始 有三種形式1.preview(儀器直接開始) 2.singe run(單筆分析) 3.sequence run(照所設定的sequence分析)

  27. 第3節分析結果 1.分析結果(10ppm為例)

  28. 第3節分析結果 2.設定積分參數 也可點選這直接由圖上設定

  29. 第3節分析結果 1.選用正確波長積分 3.積分表 4.設定數值 3.開始及停止時間 2.不同積分事件

  30. 第3節分析結果 4.積分結果 積分結果(Area及RT)

  31. 第3節分析結果 5-1.Peak/Group設置 1.Peak名稱 2.RT設定(判斷peak之依據) 3.選用正確波長

  32. 第3節分析結果 5-2.Peak/Group設置 設置標準品濃度(最多10筆)

  33. 第4節檢量線製作 1.設置新的sequence 1.先點這 3.選擇From existing data file 2.出現後按這

  34. 第4節檢量線製作 2.載入所要的檔案(檢量線及要比對的檔案) 載入檔案

  35. 第4節檢量線製作 3.出現新的sequence Level要設定(其濃度由PDA Options鍵入)

  36. 點擊這 第4節檢量線製作 4.按下Process進行分析

  37. 點擊這 第4節檢量線製作 5.分析完後,按Review Peak Calibration

  38. 第4節檢量線製作 6.檢量線繪出 1.方程式及R值 2.按右鍵,選通過原點

  39. 第5節報告製作 1.開啟custom Report

  40. 第5節報告製作 1.開啟報告類型(依照需要而選擇) 本實驗用Area-1

  41. 第5節報告製作 2.報告整理(可點選右鍵加入所要呈現的訊息) 由此加入一些資料或圖譜

  42. 第5節報告製作 3.開啟預覽,若可行則就可print 1.預覽報告 2.print

  43. 第3章 總結 A.感想 1.本教學尚有很多原理或概念未能一一詳述,敬請見諒 2.軟體操作,需要自行使用後才能了解 3.本教學的注意事項是為了保護HPLC能使用更久 4.報告整理需要有耐心,因不是容易上手 5.本片僅供參考

  44. 第3章 總結 B.流程回顧 5-2.檢量線繪製 1.Solvent配製及樣品準備 6.報告整理 2.Pump設置 5-1.積分設定 7.輸出 3.儀器condition 5.資料分析 4.軟體設定 4-1.method 4-2.sequence 4-3.run

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