Agentes infecciosos e as respectivas técnicas de análise molecular qualitativa e quantitativa

1. Agentes infecciosos e as respectivas técnicas de análise molecular qualitativa e quantitativa A aplicação dos métodos de biologia molecular p/ a identificação e caracterização de agentes infecciosos tem apresentado rápida evolução nos últimos anos ,devido, em grande parte, ao desenvolvimento de novas tecnologias de análise do DNA e do RNA e à maior disponibilidade do testes diagnósticos em laboratórios clínicos e epidemiológicos Com os métodos atualmente em uso, é possível identificar e quantificar bactérias,vírus, fungos,protozoários em um prazo de poucas horasgarantindo sensibilidade e especificidade elevada. maranhao@ensp.fiocruz.bremaranhao@hotmail.com E. Maranhão Grupo do PAI/PNI na Ensp/Fiocruz Material elaborado p/ o curso de especialização em investigação epidemiológica de campo- Dpto de epidemiologia e métodos quantitativos em saúde- Ensp/Fiocruz-2009 Fundação JPM

2. Técnicas de análise molecular qualitativa[1]eagentes infecciosos • Microorganismos métodos* materiais biológicos • Papilomavírus humano Captura híbrida Raspado da lesão suspeita, • hibridização em situ raspado de colo de útero, • biópsia • HIV-1 PCR,NASBA,TMA sangue • Vírus da hepatite B(HBV) PCR,PCR em tempo real sangue • Vírus da hepatite C(HCV) RT-PCR,TMA,PCR em tempo real sangue • Chlamydia trachomatis PCR,LCR,captura híbrida,TMA Raspado de colo de útero, • urina, raspado ureteral • Neisseria gonorrhoeae PCR,LCR,captura híbrida Raspado de colo de útero, • urina,raspado ureteral • ESPM

3. Técnicas de análise molecular qualitativa[2] • Microorganismos métodos* materiais biológicos • Toxoplasma gondii PCR, PCR em tempo real sangue,liquido amniótico • Micobactérias PCR, PCR em tempo real escarro, lavados, urina • TMA biópsia • Citomegalovírus PCR,NASBA,PCR em tempo real sangue,urina,liquor • Herpes simples tipos 1 e 2 PCR,PCR em tempo real sangue , liquor • Vírus Epstein –Barr PCR,PCR em tempo real sangue • Parvovírus B 19 PCR,hibridização sangue • Eritrovírus B 19 PCR sangue, liquido • amniótico • ESPM

4. Técnicas de análise molecular qualitativa[3] • Microrganismo métodos* materiais biológicos • HTLV-1 e HTLV-2 RT-PCR sangue,liquor, biópsia • Vírus da dengue PCR,PCR em tempo real sangue • Vírus da rubéola RT-PCR sangue • Herpesvírus-8 PCR sangue • Herpes vírus-6 PCR sangue, liquor • Vírus JC PCR liquor • Enterovírus PCR liquor,sangue • Vírus da caxumba RT-PCR liquor ESPM

5. Métodos * • Obs::Estas não são as única técnicas disponíveis, mas as + comumente empregadas p/ investigação de cada um dos microorganismos :: •  PCR [polymerase chain reaction] ; •  RT-PCR [reverse-transcribed polymerase chain reaction] ; •  NASBA [nucleic acid sequence-based amplification] ; • LCR [ligase chain reaction] ; • TMA [transcription mediated amplificacion] . • OBS:A metodologia do PCR e suas variantes(RT-PCR,PCR em tempo real) são as + amplamente utilizadas como método de detecção qualitativa • ESPM

6. Técnicas de análise molecular quantitativa[1]Agentes infecciosos • Vírus métodos* materiais biológicos • HIV-1 RT-PCR,b-DNA,NASBA sangue • Vírus da hepatite B (HBV) PCR,b-DNA,PCR em tempo real sangue • Vírus da hepatite C (HCV) RT-PCR,b-DNA,PCR em tempo real sangue • Citomegalovírus PCR,NASBA,PCR em tempo real sangue, urina, liquor • Vírus Epstein-Barr PCR,PCR em tempo real sangue,liquor • Obs:: • PCR [polymerase chain reaction] ; • RT-PCR [reverse-trancribed polylerase chain reaction] ; • B-DNA [branched-DNA] • NASBA [nucleic acid sequence-based amplification] . • ESPM

7. Glossário[1] •  Polymerase Chain Reaction O método PCR consiste na amplificação de um segmento específico do DNA com a utilização de 2 oligonicleotídeos ( iniciadores ou primers) e da enzima DNA polimerase. • RT-PCRé um método de amplificação realizado a partir de moléculas de RNA.Após a extração do RNA,sintetiza-se cDNA (DNA complementar) empregando-se a enzima transcriptase reversa de origem viral. A partir do cDNA, emprega-se o método de PCR para amplificação. • PCR em Tempo RealO método do PCR em tempo real emprega os mesmos princípios do PCR convencional, mas com acompanhamento contínuo da reação, permitindo a quantificação precisa do material amplificado a cada ciclo de amplificação por meio da detecção de luz emitida por corantes fluorescentes. ** Obs:Atualmente o método do PCR em tempo real é considerado um dos métodos de escolha p/ testes moleculares quantitativos e qualitativos em decorrência de suas vantagens sobre o PCR convencional:: • + or rapidez de execução; • +ores sensibilidade e reprodutibilidade; • - or risco de contaminação de amostras no ambiente laboratorial,devido a ausência de manipulação das amostras após o processo de amplificação.

8. Glossário[2] • TMA e NASBAsão métodos de amplificação isotérmica. • Branched-DNAApós a extração do RNA, um conjunto de sondas é empregado p/ captura das moléculas de RNA em uma microplaca. Outros 2 conjuntos de sondas ligam-se então ao RNA capturado , e um substrato é adicionado p/ o complexo enzimático associado à sonda. A leitura dos resultados é feita por quimioluminescencia. • Captura hibrida  é um método que tem sido utilizado largamente na detecção e subtipagem do papilomavírus humano.É um método de identificação direta do DNA.Como inúmeras moléculas do anticorpo conjugado se ligam a cada híbrido capturado, ocorre um “amplificação” do sinal, o que determina boa sensibilidade do método. • Sequenciamento do DNA é um método que permite definir a seqüência de bases de um segmento específico do DNA.Atualmente, é realizado por meio de equipamentos -sequenciadores de DNA-, que permitem a análise automatizada de grande número de segmentos em poucas horas. ESPM

9. Referência • Burke W. Genetic Testing.New England Journal of Medicine 2002;347:1867-1875. • Mauro S. Figueiredo.Fundamentos de Biologia Molecular e sua importância clínica. • Connor J M, Fergunson-Smith M A . Essential Medical Genetics,#rd edition.Blackwell Scientific Publicatios,1991.