Cap 10 – Análisis de Genes y Genomas

1. Cap 10 – Análisis de Genes y Genomas JA Cardé, PhD Universidad Adventista Alberts et al.

2. Objetivos • Al finalizar la presentación el estudiante podrá: • Definir biotecnología • Conocer los mecanismos de corte y unión del DNA por enzimas • Conocer métodos de visualización de las moléculas orgánicas. • Establecer diferencias, parecidos la importancia y los diferentes tipos de vectores y bibliotecas • Conocer distintas aplicaciones de la biotecnología

3. Biotechnology 3 greeks roots • Bios - life • Teuchos - tools • Logos - study • Study of tools from living things

4. Biotechnology “The application of science and technology to living organisms, as well as parts, products and models thereof, to alter living or non-living materials for the production of knowledge, goods and services.”

5. Biotechnology Biotechnology means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make or modify products or processes for specific use.” - Wikipedia.org

6. Biotechnology • Using living organisms, their products or derivatives as tools to solve human issues to improve our life quality. • - Organisms: Model systems • Products: Proteins, Antibiotics, Genetically Modified Products (GMPs) • Issues: health, environmental, economical

7. ¿Qué es biotecnología? • Es el uso de organismos vivos, o sus productos para mejorar nuestra calidad de vida y/o nuestro ambiente. • Dependiente grandemente de avances en: • Biología molecular • Métodos y/o Tecnología de DNA recombinante

8. 10_04_Restrict.nuclease.jpg M a n I p u l a c I ó n del DNA Enzimas de Restricción Palíndromes 5’ GTAATC 3’ 3’ CTAATG 5’ Cohesivos Romos Nomenclatura Aplicaciones

9. Analisis y Visualización de DNA 10_05_gel.electrophor.jpg Azul Met EtBR-UV Radioactividad

10. Como se verá la gel? EcoRI 5GA / ATTC5 3CTTA / AG3 Alu I 5AG / CT 3 3TC / GA5 Not I 5GC / GGCCGC3 3CGCCGG / CG5 LAS 3 A LA VEZ?!!! 5’AAGAATTCGCGGAATTCGAGCTTAAGGGCCGCGCGCCGAAGCTTTAAA3’ 3’ TTCTTAACGCCTTAAGCTCGAATTCCCGGCGCGCGGCTTCGAAATTT 5’

11. Mapas de Restricción Clonos de BAC Varias enzimas - individuales y en conjunto Solapamientos 10_11_BAC.clones.jpg

12. Denaturación y Renaturación DNA - DS - Complementaridad - GC / AT 3 enlaces vs 2 enlaces; TM Complejidad del Genoma – Experimentos Cot 10_12_de_renaturation.jpg Secuencias altamente repetitivas Moderadamente Repetitivas Unicas

13. Southern/Northern Blotting 10_14_1_Southrn.blotting.jpg

14. Visualización 10_14_2_Southrn.blotting.jpg

15. 10_18_ DNA.in.vitro.jpg Moléculas Quiméricas Ligación = Clonación Cortes Ligación y/o Complementaridad

16. Transformación Bacteriana – Griffith Competencia 10_19_DNA.uptake.jpgTra Transformacion 2

17. 10_20_Bacteria.plasmid.jpg Plasmidos Bacterianos Vectores Ori Antibiótico MCS/Polylinker ORF Ejemplos: pAMP pKAN pBLUE

18. 10_21_DNA ligase.jpg Digestión/Digestión Cloning Ligación Quimera Transformación Cultivo/Resistencia

19. Transformación – Selección - Replicación – DNA Miniprep 10_22_cloned.DNA.frag.jpg Transformacion 1

20. 10_23_genomic.library.jpg • Bibliotecas: Genómica • Restricción • Ligación • Clonación • Replicación • Selección

21. Screening - Replica plating - Probing radioactivo - Autoradiografía 10_24_hybridization.jpg

22. 10_25_cDNA.jpg Bibliotecas: de cDNA mRNA Total Oligo dT RT RNAsa H DDDP - replicación DS DNA copia mRNA ClonarSelecciónScreen.

23. 10_26_Genomic_cDNA.jpg vs

24. Reacción de la Polimerasa en Cadena: PCR • Objetivo • aplicaciones 10_27_1_PCR_amplify.jpg

25. 10_27_2_PCR_amplify.jpg PCR 1, PCR 2

26. Aplicación-cloning 10_28_PCR_clones.jpg

27. Aplicación – detección/diagnóstico 10_29_PCR_viral.jpg

28. Aplicación - Forense - VNTR 10_30_1_PCR_forensic.jpg

29. 10_30_2_PCR_forensic.jpg

30. Aplicación - Secuenciación 10_07_1_enzym.dideoxy.jpg Secuenciacion Di-deoxi

31. 10_07_2_enzym.dideoxy.jpg 4 reacciones ddNTPs PCR PAGE Autoradiografia

32. 10_08_DNA.sequencing .jpg Secuencia Digitalizada/Color Code PCR / Fluorescencia http:www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

33. 10_31_SerialDNA.clone.jpg Clonación en secuencia Para unir un grupo de fragmentos derivados de distintos origenes

34. Vectores de Expresión • Ori, Antibiotico, Polylink • Promotor eficiente • Senales de poliA etc • Transformado en celulas 10_32_expressionvector.jpg

35. 10_33_gene_protein.jpg Dogma Central Repensado - huevo o gallina/gen o proteína?

36. Genes Reporteros • Determinar el patron de expresion de un gen • Quiero saber cualceluaexpresa a X, proteinaindetectable 10_34_Reporter.genes.jpg cual será el efecto de seq 1 sobre seq 3)

37. GFP: Gen Reportero Promotor de neurona con GFP Neuronas expresando GFP 10_35_GFP.jpg

38. Hibridización In situ • Detección de la presencia de papiloma humano • Sonda pink complementaria al genoma viral

39. 10_16_In.situ.hybrdztn.jpg In situ En cromosomas Localizar genes Cromosoma 5 2 pts/por cada gen, WHY?

40. Diagnóstico Screening poblacional para Sckl cell anemia 10_13_hybridization.jpg Diagnósticos

41. DNA Microarray - Para monitorear la expresión de miles de genes a la vez ER No Rx 10_15_DNA.microarrays .jpg ER Rx cDDNs de dos celulas para comparar expresion Marcarlos fluorescente(rojo/verde) Mezclar e hibridizar con el array Lavados, Rastreos, Lectura 110 genes Rojo A > B o Verde B>A o Amarillos Análisis: spot Rojo, este gen es del pool R, donde se expresa mas que en el otro pool, lo mismo para verde

42. Site Directed Mutagenesis 10_36_mutagenesis.jpg

43. 10_37_engineered.org.jpg Sustituciones: mutantes, KO, doble copia

44. Transgénicos 10_38_ES.cells.jpg

45. 10_39_Transgenic.mice.jpg

46. 10_40_Transgenic.plant.jpg Transgénicos

47. ¿Preguntas?