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Lehrerfortbildung Juli 2011

Lehrerfortbildung Juli 2011. Schülerversuch Geninduktion am Beispiel des lac-Operons von E.coli Prof. Dr. Andreas Beyer cand. stud. Yvonne Floer cand. stud. Karina van den Broek

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Lehrerfortbildung Juli 2011

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Presentation Transcript

  1. Lehrerfortbildung Juli 2011 Schülerversuch Geninduktionam Beispiel des lac-Operons von E.coli Prof. Dr. Andreas Beyer cand. stud. Yvonne Floer cand. stud. Karina van den Broek Ein Schul-tauglicher Versuch zur Untersuchung genetischer Regulation bei Bakterien: – Induktion und Repression –

  2. Das lac-Operon Lac tose RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term lacZ,Y,A-mRNA Gal + lac-Permease ßGal trans-Ac Glc

  3. Das lac-Operon: Der Repressor lacZ,Y,A-mRNA lac-Permease ßGal trans-Ac RNA -Pol Promotor lacI Term lacI-mRNA LacR RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term

  4. Das lac-Operon: Der Repressor lacZ,Y,A-mRNA lac-Permease ßGal trans-Ac Lac tose RNA -Pol Promotor lacI Term lacI-mRNA LacR RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term

  5. Das lac-Operon: Glc-Repression lacZ,Y,A-mRNA lac-Permease ßGal trans-Ac Lac tose RNA -Pol Promotor cAMP-RP Term cAMP CRP-mRNA CRP RNA -Pol RNA -Pol CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term LacR

  6. Regulation des lac-Operons • negatives Regulations-Element im Promotor:lacR bindet an Operator  blockiert Transkription in Abwesenheit vom LaktoseInduktor Laktose bindet an lacR LacR kann nicht mehr binden, Transkription ist entblockt • positives Regulations Element im Promotor:aAMP-CRP komplex bindet an CRP-Bindestelle Transcriptionslevel wird erheblich gesteigert (Mechanismus der Katabolit-Repression)

  7. Regulation des lac-Operons Lac tose lac-Operon CAPbs Promotor Operator lacZ lacY lacA Term LacR X X ++ ++ CRP cAMP Transkription des lac-Operons

  8. Das Versuchsprinzip lacZ  ß-Gaslactosidase als Reporter:Quantifizierung des Aktivitätsstatus‘ des lac-Operons über Aktivitätsmessung der ß-Gal. via Chromogen:proportionale Umsetzung von oNPG durch das Enzym Quelle: chemgapedia

  9. Vorversuch: Wachstumskinetik Extinktion Zeit t in Minuten

  10. Vorversuch: Wachstumskinetik  Glycerin verworfen

  11. Setup des Versuchs • E.coli H3000: intaktes lac-Operon • Sicherheitsstamm (keine S-Stufe!) • frische Übernacht-Kultur Standard-Medium LB • 1:5 Verdünnung mit div. C-Quellen (Kinetik über 1h): • nur LB • Glucose • Laktose • Glucose + Laktose • Zentrifugation, Zellaufschluss • Zugabe von oNPG  definierte Zeit  Stopp • optische Auswertung (semiquantitativ) • Analyse: Korrelation mit den C-Quellen

  12. Setup des Versuchs 1:5 Verdünnung bei t=0 E.coli H3000: frische Übernacht-Kultur (Standard-Medium LB) • nur LB …+Glc …+Lact …+Glc +Lakt Probennahme alle 20min Farb-test Zellaufschluss (Lysozym)

  13. Ergebnis

  14. semiquantitative Auswertung (Semi-)Quantifizierung mit Photoshop

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