Células Dendríticas: Um Vigilante contra o cancro/Explorando Novas Vacinas

1. Células Dendríticas: Um Vigilante contra o cancro/Explorando Novas Vacinas DOMINGOS, Cátia1; FARINHA, Diogo2; FERREIRA, Mariana3; LAMY, Ana1; CABRAL, Guadalupe4; SILVA, Zélia4 1Escola SecundáriadaAmadora, 2Colégio SagradoCoração de Maria; 3Escola Secundária José Gomes Ferreira; 4Universidade Nova de Lisboa , Centro de Estudos de DoençasCrónicas – CEDOC – Faculdade de CiênciasMédicas Na última década, têm-se realizado inúmeros estudos na tentativa de manipular o sistema imunitário com o objectivo de produzir vacinas celulares para usar como terapia. Neste sentido, tem-se estudado o potencial de um tipo de células do sistema imunitário – as Células Dendríticas (DCs, dendritic cells). As DCs são células com longas extensões membranares que têm elevada capacidade fagocítica no estado imaturo e capacidade profissional de apresentação de antigénios processados aos linfócitos T. A activação destes linfócitos é, por sua vez, essencial para uma resposta eficaz contra organismos invasores ou contra células cancerígenas. O processo de produção de células dendríticas para utilizar em imunoterapia envolve o isolamento de monócitos do sangue periférico e sua diferenciação in vitro em células dendríticas. Estas células são designadas dendríticas derivadas de monócitos e são re-inoculadas no paciente após terem contactado com antigénios tumorais do mesmo. • OBJECTIVOS • Contacto com o procedimento de obtenção de células dendríticas (DCs) a partir de monócitos – Isolamento de Monócitos; • Familiarização com técnicas de laboratório normalmente utilizadas para o estudo das células; • Caracterização fenotípica das células nas várias fases de isolamento – Monitorização do Isolamento. • A técnica de Citometria de Fluxo foi usada para: • Monitorização de todas as fases do processo de isolamento de monócitos a partir de sangue periférico; • Avaliação da eficácia da estimulação das DCs pelo LPS. Neste trabalho, procedeu-se ao isolamento de monócitos e induziu-se a sua diferenciação em células dendríticas por adição das citocinas IL4 e GMCSF ao meio de cultura. Seguidamente, induziu-se a maturação das DCs, por estimulação com LPS, e avaliou-se a eficácia desta estimulação. MONITORIZAÇÃO DO ISOLAMENTO - RESULTADOS EXPERIMENTAIS Método Utilizado – Citometria de Fluxo – Fenotipagem das DCs PROCEDIMENTO Duas lavagens e centrifugação com PBS Centrifugação em anel leucocitário descontínuo Dimensão e nível de complexidade das células Nível de expressão de CD14 nas células 1- ISOLAMENTO DE MONÓCITOS A PARTIR DE SANGUE PARA OBTENÇÃO DE DCs Plasma Plasma Observou-se a presença de duas populações: Linfócitos eMonócitos. Amostra Centrifugação Centrifugação 1.1. Leucócitos Anel Leucocitário 1.2. Ficoll Gráfico 1.1.: Linfócitos – pequenas dimensões; Monócitos – maiores dimensões. Gráfico 1.2.: Linfócitos – CD14- e CD3+; Monócitos – CD14+ e CD3-. Eritrócitos Amostra de Sangue Ficoll Eritrócitos e Granulócitos Retirou-se uma alíquota para se fazer a monitorização • Remoção do plasma • Remoção do anel leucocitário • Adição de Ficoll • Remoção do anel leucocitário • Adição de PBS Legenda gráficos 3.1, 3.2. e 3.3.: DC não estimuladas HLA-DR, CD83, CD45, CCR7 DC não estimuladas CD45 DC estimuladas com LPS HLA-DR, CD83, CD45, CCR7 DC estimuladas com LPS CD45 Nível de expressão de CD3 nas células Nível de expressão de CD14 nas células • Observou-se que as células desta alíquota: • Gráfico 2.1.: • Expressavam CD3. • Gráfico 2.2.: • Não expressavam CD14 . • Foram removidos os linfócitos da amostra (CD3+ e CD14-). 2.1. 2.2. Recolha de amostra que não marca com CD14 2- SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA COM COLUNAS LS Retirou-se uma alíquota de cada tubo de ensaio para se fazer a monitorização Recolha de amostra que marca com CD14 “Tampão Beads” e marcação de monócitos com CD14 MicroBeads Coluna Magnética Nível de expressão de CD14 nas células Nível de expressão de CD3 nas células Observou-se que: Gráfico 2.3.: 89,13% das células não expressavam CD3; 1,52% das células expressavam CD3. Gráfico 2.4.: 89,13% das células expressavam CD14; 1,52% das células não expressavam CD3. 9,53% das células são contaminantes (granulócitos). Ou seja, 89,13% das células são monócitos, não expressavam CD3 e expressavam CD14 e 1,52% das células são linfócitos, expressavam CD3 e não expressavam CD14. 2.4. 2.3. Diferenciação de monócitos em células DCs Maturação das DCs induzida no 5º dia de diferenciação das células 3- CULTURA DE CÉLULAS COM INDUÇÃO DE DIFERENCIAÇÃO EM DCs Nível de expressão de CD83 nas DCs Nível de expressão de HLA-DR nas DCs Nível de expressão de CCR7 nas DCs 3.1. 3.3. 3.2. Citocinas IL4 e GMLCSF Estímulo LPS Monócito DC imatura DC matura Legenda gráficos 1.1, 1.2., 2.1., 2.2, 2.3.,2.4.: CD14- HLA-DR++ CD83- CCR7- CD14- HLA-DR+++ CD83+ CCR7+ t = [1;5[ dias t = [5;6[ dias Observou-se um aumento na expressão dos marcadores HLA-DR e CD83( gráficos 3.1. e 3.2., respectivamente). Linfócitos Monócitos Contaminantes CONCLUSÕES A Citometria de Fluxo é uma técnica comummente utilizada na fenotipagem e contagem de células, dado que avalia vários parâmetros como o volume, a complexidade morfológica e fluorescência da célula. Para a monitorização do isolamento de monócitos, utilizaram-se os anticorpos anti-CD3, que marcaram os linfócitos, e anti-CD14, que marcaram os monócitos. Antes de aplicar a amostra na coluna, esta continha monócitos e linfócitos. Após aplicação da amostra na coluna, obteve-se duas fracções: a CD3+; CD14-, maioritariamente com linfócitos, e a CD3-;CD14+, maioritariamente com monócitos. A segunda fracção tinha um grau de pureza de 89%, pelo que se conclui que o processo de isolamento foi bem sucedido. O LPS foi eficaz na indução da maturação das DCs, aumentando a expressão dos marcadores HLA-DR e CD83. Observou-se, no entanto, que algumas das DCs diferenciadas tinham iniciado o processo de maturação na ausência de estímulo (LPS), daí a presença de dois picos nos níveis de expressão de HLA-DR nas DCs não estimuladas. Agradecimentos:Universidade Nova de Lisboa, Centro de Estudos de DoençasCrónicas – CEDOC – Faculdade de CiênciasMédicas (Dra. Guadalupe Cabral e Dra. Zélia Silva) e à Ciência Viva.