Allergi (diagnostikk in vivo og in vitro)

1. Allergi (diagnostikk in vivo og in vitro) Nettverksundervisning 10. juni 2010 kl 9.15-10 Kst. overlege Eli Taraldsrud

2. Allergi, historikk • 1906 Clemens Peter Freiherr von Pirquet, Østerrike: allergi (gr. allos= annen og ergon= reaksjon) • 1921 Prausnitz og Küstner: overføring ved serum PK-testen • 1923 Coca and Cooke: atopi (gr. et annet sted) • 1965 Gell og Coombs: hypersensitivitetsreaksjoner • 1965 WHO: IgE (Ishizaka, USA; Bennich og Johansson, Sverige; Humphrey og Stanworth, England) Clemens von Pirquet

3. Allergi, sensibilisering Nature Rev Immunology 2008; Galli et al.

4. Tidlig fase allergisk inflammasjon Nature Rev Immunology 2008; Galli et al.

5. Sen fase allergisk inflammasjon Nature Rev Immunology 2008; Galli et al.

6. Basofile og mastceller Basofil granulocytt Mastcelle

7. IgE antistoffet Nature Rev Immunology 2008; Gould et al.

8. Hypersensitivitetsreaksjoner – ”An EAACI position statement from the EAACInomenclature task force” (EAACI= European Academy of allergy and Clinical Immunology) Allergy 2001; Johansson et al et al.

9. Allergener • Antigener som kan utløse en hypersensitivitetsreaksjon, NB! europeisk definisjon • Glykoproteiner, lipoproteiner, insektsgifter, medikamenter • Sensibilisere, binde IgE antistoffer, utløse en hypersensitivitetsreaksjon • Komplette og inkomplette allergener • Major allergen og minor allergen J Allergy Clin Immunol 2007, Chapman

10. Et allergen skal kunne defineres utvetydig • Nukleotid- og aminosyresekvens • Molekylvekt • Isoelektrisk punkt • Sekundær struktur • Ha en homogen form i renset tilstand • Være definert ved monospesifikke antistoffer • Kan produsere IgE responser ved in vitro testing og biologisk testing • Det individuelle allergene proteinet kan identifiseres ved en rekke ulike metoder som Western blot, isoelektrisk fokusering. • Pasienter kan danne IgE antistoffer mot ett allergen med spesifisitet mot ulike bestanddeler av allergenet

11. Eksempel på et pasientpanel som reagerer på peanøttallergen Bildekilde: Anne Omholt, Phadia

12. Allergennomenlatur • Inndeling i grupper: t= treepollen, w= weed, m= micro-organisms, f= food • Allergenekstrakter: t3 = bjørk • Allergenkomponenter: t3: Bet v1, Bet v2, Bet v3, osv.... • Nomenklaturen er basert på et Linnèisk system og ivaretas av WHO/IUIS • http://www.allergen.org/ • Allergenkodene administreres av CLSI = ”Clinical and Laboratory Standards Institute” gjennom dokumentet: I/LA20-A2 ”Analytical Performance Characteristics and Clinical Utility of Immunological Assays for Human Immunoglobulin E (IgE) Antibodies and Defined Allergen Specificities; Approved Guideline-Second Edition

13. Testing i ulike format av allergen NCCLS I/LA20-A 1997

14. IgE kryssreaktivitet • Adaptiv immunrespons rettet mot et antigen som resulterer i reaktivitet mot strukturelt beslektede antigener • Samme antistoff reagerer med ulike antigener • Kryssreaktivitet er et spørsmål om affinitet • Grad av kryssreaktivitet • Konsekvens av kryssreaktivitet - falske positive, men også oralt allergisk syndrom • Forskjell mellom kryssreaktivitet og ko-sensitisering Bonds, Curr Opin Allergy Clin Immunol 2008; 8: 82-86 Allberse, Allergy, 2001;56:478-490

15. Diagnostikk av type 1 hypersensitivitetsreaksjoner • Diagnostisk hudtesting • Allergenspesifikk IgE testing • Allergenspesifikk IgE testing, multitest • Tryptase • ECP • BHR ”Basophil histamin release” / BAT ”Basophile activation test” • In vivo provokasjonstesting • Testing av inne- og utemiljø

16. Prikktesting eller SPT (= Skin Prick Test) J Allergy Clin Immunol 2010, Hamilton

17. SPT metodevariasjon • Allergenkonsentrasjon • Teknikk • Hudens beskaffenhet • Medikamenter • Blødninger i hud, dermografisme • Allergenekstraktet, kontaminasjon • Anafylaksiberedskap

18. SPT prestasjon • SPT og serologisk testing regnes som ekvivalente mtp. sensitivitet og spesifisitet ved utredning av luftveisallergier og matvareallergier • Kombineres metodene oppnås den beste sensitiviteten (Allergy Asthma Proc. 2009 Jul-Aug;30(4):386-96, ) • Comparison of serum-specific IgE (ImmunoCAP) and skin-prick test results for 53 inhalant allergens in patients with chronic rhinitis

19. Serologiske undersøkelser

20. Metodisk utfordring ved påvisning av IgE antistoffer RAST Radioallergosorbent test utviklet i 1967 1. Inkubasjon 4 timer: s-IgE i serum bindes til fast fase 2. Inkubasjon 16-18 timer: IgE detekteres med et anti-IgE antistoff merket med radioaktivt Jod

21. Testing i ulike format av metode IMMULITE 2000, Siemens, Berlin ImmunoCAP 250/1000, Phadia, Uppsala HYCOR Ultra-Sensitive EIA System, HYCOR, USA

22. ISAC Immuno solid-phase allergen chip

23. Komponentoppløst diagnostikk- Mulige anvendelsesområder • Diagnostikk av kryssreaktivitet • Prediksjon av alvorlige matvarereaksjoner • Prediksjon av alvorlige kliniske hypersensitivitetsreaksjoner • Prognose av matvareallergi • Veiledning ved tilrettelegging av immunterapi

24. Hva slags informasjon gir allergenspesifikk IgE?

25. Diagnostisk 1: Sammenheng mellom nivå av allergen spesifikke IgE og allergisk reaksjon på matvare Sampson, J Allergy Clin Immunol, 1997, Sampson, J Allergy Clin Immunol 2001, Eigenmann, Pediatr Allergy Immunol, 2000

26. Diagnostisk 2: Sammenheng mellom nivå av allergen spesifikke IgE og allergisk reaksjon i luftveiene-prediktiv verdi (Søderstrøm, Allergy; 58:921-928)

27. Prediktivt 1: Sammenheng mellom nivå av allergen spesifikke IgE og allergisk reaksjon i luftveiene- prediktiv verdi • Sensibilisering mot midd økte risiko 3,4-19,7 ganger for utvikling av astma senere i livet (Peat, J Allergy Clin Immunol 1999;103:3-10) • Sensibilisering mot egg hadde positiv prediktiv verdi for utvikling av astma på 95 % (Wahn, Pediatr Allergy Immunol, 1997; 8:16-20) • Bakgrunnen for begrepet ”Allergimarsjen”

28. Bruk av IgE screening assay (også kalt paneler) • Testing på opptil 15 ulike allergenspesifisiteter samtidig • Få/ ingen tegn til atopi hos pasient gir høy negativ prediktiv verdi på testen • Økte verdier av Phadiatop eller F x 5 er assosiert med økt sannsynlighet for IgE-mediert allergisk manifestasjon hos 4-åringer (Wickman, Pediatr Allergy Immunol 2003; 14:441-7) • Vist seg å være et bedre verktøy for diagnostikk av atopi enn total IgE

29. Anafylaktisk reaksjon • Definisjon av anafylaksi • Ormegift, anestesimidler, radiokontrastmidler, antibiotika, matvarer

30. Tryptase biologisk funksjon • Tryptase= enzym (Serinesterase) • Frigjøres fra mastceller i akuttfasen av en allergisk reaksjon • Forekommer som inaktive monomerer (α-tryptase) og aktive tetramerer (β-tryptase). • Aktiverer matrixmetalloproteinase • Mastceller inneholder 300-700 x mer tryptase enn granulocytter og eosinofile • Halveringstid i serum er 2 timer

31. Tryptase ved diagnostikk • Måler total tryptase= α-tryptase og β-tryptase • Stabilt høye nivåer ses ved mastocytose • Ved anafylaksi vil økningen skyldes økt β-tryptase, økningen er omtrent 3 ganger basalnivået • Tryptase når toppnivå et par timer etter mastcelleaktivering • Målingen presterer bedre dersom en tar utgangspunkt i sammenligning av målt nivå ved reaksjon med målt nivå ved base-line • Enrique, Allergy 1999: Sensitivitet: 35,3 %, spesifisitet: 93,31 % ved cut-off= 13,50 ng/mL

32. ECP =(eosinofilt cationisk protein) • Eosinofile granulocytter (EG) innholder granula med basiske proteiner • ECP er et protein som er toksisk for parasitter og frigjøres ved aktivering av EG • Økte mengder EG produseres i benmargen ved Th2-responser via cytokiner • Økte mengder ECP synes å reflektere økt mobilisering av EG fra benmargen • ECP øker ved inflammatoriske tilstander som astma, allergisk rhinokonjunktivitt, atopisk eksem blant annet • Serum/ plasma evt. andre sekreter • Komplisert prøvetakingsprosedyre

33. Diagnostisk verdi av ECP målt i serum/plasma • Diagnostikk av matvareallergi (Saarinen, Clin Exp Allergy 2001)- Liten diagnostisk verdi • Diagnostikk av astma (Njå, Allergy 2001)- Liten diagnostisk verdi • Diagnostikk av matvareintoleranse (Winqvist, Allergy 19889) –Liten diagnostisk verdi • Monitorering av allergisk inflammasjon, kanskje uavklart (Venge, Allergy 2004)

34. Cellulære undersøkelser: Basofil aktivering

35. Basofil histamin frigjøringstest BHR • Prøvemateriale: fullblod, isolerte MNC (basofile granulocytter), serum • Metode: direkte provokasjon på pasientens egne celler eller passiv sensibilisering av donorceller med pasientserum • Stimuli: allergenekstrakter, medikamenter, stoffer, anti-IgE • Måling: Histamin, tryptase, leukotrien • Målemetode: RIA, ELISA, HPLC

36. CAST ELISA Bühlmann laboratorier – eksempel på kommersiell test

37. Prestasjon B HR Clin Exp Allergy 2001, editorial; Crockard

38. Prestasjon Basolfil leukotrien tester Clin Exp Allergy 2001, editorial; Crockard

39. Basofil aktivering (BAT) målt med flowcytometri • CD63 eller CD203c • Lokalisert i granula på innsiden av cellemembranen • Stimulering med allergener • Farging anti-CD63, anti-IgE evt. CD45 • Akvirering med flowcytometer min. 500 BG

40. ”Gating”-strategi ved BAT flowcytometri Journal of Immunology 2007, Ocmant et al

41. Basotest, Orpegen Pharma – eksempel på kommersiell BAT Stimulering med gresspollen Negativ kontroll Positiv kontroll fMLP

42. Prestasjon BAT målt med flowcytometri Clin Exp Allergy 2001, editorial; Crockard

43. Tekniske aspekter BHR/ BAT • Prøvemateriale • Allergenekstrakter • Tidkrevende og kostbare • Variasjon, behov for standardisering

44. In vivo provokasjonstesting

45. In vivo bronkoprovokasjonstesting

46. In vivo nasal provokasjonstesting

47. Dobbelt-blind placebo-kontrollert matvare provokasjonstest DBPCFC

48. Allergener i innemiljøet

49. Allergener i utemiljøet

50. Slutt