高效液相色谱（ HPLC ）简介

高效液相色谱（HPLC）简介 盛卫坚

目录 1, 液相色谱分析法的发展 2, 高效液相色谱的特点 3, 高效液相色谱仪简介 4, 液相色谱法介绍 5, 分析方法的选择 6, 实际分析操作过程

1、液相色谱分析法的发展 • 20世纪初：俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。 • 20世纪60年代末：随着色谱理论的发展、高效细微固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。

2 HPLC的特点 2.1HPLC的特点（一）

２.2 HPLC的特点（二）

3、液相色谱仪简介 贮液罐A 高压输液泵A 阻尼器A 贮液罐B 高压输液泵B 阻尼器B 初步混合器压力传感器混合器进样器色谱柱检测器谱图输出

3.1高效液相色谱仪构造

3.2　高压输液泵简介 高压输液泵的一般要求：　　泵体材料耐酸、耐碱、耐化学腐蚀；　　耐压40 ～50MPa，能连续工作；输出流量稳定，重复性佳；　　输出流量范围宽，对填充柱：0.1 ～100mL／min。　　　　　　　　　注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。 ◆恒流泵　　　　　　　　往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。 ◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定；　　　　　　　　　　　　　

3.3　阻尼器介绍 阻尼器----消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。

3.4.1 检测器简介（一） ◆紫外吸收检测器（UVD）原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）。 ◆　折光指数检测器（RID）原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。特点：通用性检测器，温变化要保持在±0.001℃、灵敏度低（10-6g）。

3.4.2 检测器简介（二） ◆ 电导检测器（ECD）原理：监测溶液的电导率变化的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。 ◆ 荧光检测器（FLD）原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。　　　　　　　　　　　　　　　　　

3.4.3 检测器简介（三） ◆ 蒸发光散射检测器（ELSD）原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。

4、色谱分析法简介 4.1.1　色谱分析法介绍（一）液固色谱------以固体吸附剂为固定相，依靠吸附－脱附平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。　　　特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。液液色谱------以吸附载带在惰性固相载体上的极性或非极性固定液为固定相，依靠溶解－解吸平衡实现分离。　　　特点：固定液可选择余地大，重现性、分离效果好。

4.1.2色谱法简介（二） 体积排阻色谱法--------以多孔性凝胶为固定相，借助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别先后流出。　　　特点：洗脱时间短，但不适于分离组成复杂的混合物。适用范围：分子量差别较大的样品。离子对色谱法--------分析离子化的强极性化合物。亲和色谱法等等

4.1.3 色谱法简介（三） ◆键合相色谱法简介键合相色谱-------是由液液色谱发展起来的，在高效液相色谱法中占有极其重要的地位。将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，解决固定液的流失问题,是目前用的最多的一种色谱分析法。根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，分为正相键合相色谱法与反相键合相色谱法。正相键合相色谱------固定相极性强；反相键合相色谱------固定相极性弱。

４.2.1 色谱柱简介（一） • 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。 • 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。

4.2.2 色谱柱简介（二） 聚合物填料柱------通常为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等. 优点：PH值为1—14均可使用；具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。　缺点：色谱柱柱效较低。其它无机填料柱------如石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用，石墨化碳可用于分离某些几何异构体。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。

4.2.3 色谱柱简介（三） • 手性柱-------将手性聚合物共价键和到硅胶上，实现外消旋物的广泛分离。如下图：特点：具有专一性、通用性不广。　　　价格较贵。

5、分析方法的建立 5.1 色谱柱的选择：　　疏水性的样品——反相键合色谱；　　亲水性的样品——正相键合色谱；　　生物大分子 ——体积排阻色谱；　　无机离子化合物——离子对色谱；　　高分子聚合 ——凝胶色谱；　　同系物的分离——吸附、分配和键合色谱；　　同分异构体　——双键或取代基异构用吸附色谱； ——多环芳烃异构选用反相键合；　　对映异构体 ——流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。

5.2 流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择 • 根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。 • 为达到较好的分离效果，确定流动相配比。 • 流动相的总流量增加，通常柱效增加。 • 梯度洗脱--------在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时。 • 特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及调节流动相的Ph值来改善峰型。

5.3 样品组分保留值和容量因子的选择 1. 分析时间控制在10～30min ； 2. 容量因子控制在1～10，对于复杂的样品，容量因子范围较宽的通常使用梯度洗脱技术。　容量因子定义：调整保留时间与死时间之比，即可表示为: 3. 相邻组分分离度的要求：　　　　对于难分离的样品,要求分离度R≥1.0。

6、样品分析方法介绍 6.1流动相及样品的准备 1，流动相的准备　　流动相的选择------有机相（甲醇、乙腈）与水（去离子水、缓冲溶液）　　流动相的过滤------用孔径为0.45μm滤膜过滤除去固体颗粒杂质。　　流动相的脱气------超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。 2，样品的准备称量、用流动相超声溶解、过滤。

流动相过滤器样品过滤器

6.2分析方法的设定 　流动相的配比及流量------选择何种有机相，纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相的总流量。　　　紫外检测波长的确定------通过测定被分析样品的最大吸收波长（紫外吸收检测器）。　　　是否采用梯度洗脱，确定起始配比（如20∶80)及终点配比(如80∶20)。

６.3 样品的分析 1, 选定分析条件，走基线； 2, 待基线平稳后，发出进样指令； 3, 用进样针吸取已过滤好的定量样品； 4, 进样分析，获得色谱图及分析结果； 5, 如谱图效果不佳，则改变条件后继续分析。

　　　　　谢谢大家！

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