第二十章高效液相色谱法 high performance liquid chromatography ； HPLC

1. 第二十章高效液相色谱法 high performance liquid chromatography；HPLC 分析化学教研室　李发美教授

2. 经典液相色谱法为基础， • 引入气相色谱法的理论和实验技术， • 高压输送流动相， • 高效固定相及高灵敏度检测器， • 现代液相色谱分析方法。

3. 与经典液相色谱法相比 • 颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高； • 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； • 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。

4. 与气相色谱法相比 • 不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广； • 可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高； • 一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。

5. 第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 • 一、主要类型 四类基本类型色谱法 • 分配色谱法（partition chromatography） • 吸附色谱法（adsorption chromatography） • 离子交换色谱法（IEC） • 空间排阻色谱法（SEC）

6. 第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 • 一、主要类型 四类基本类型色谱法 • 分配色谱法（partition chromatography） • 吸附色谱法（adsorption chromatography） • 离子交换色谱法（IEC） • 空间排阻色谱法（SEC） • 化学键合相色谱法

7. 其他色谱类型 • 亲合色谱法（affinity chromatography；AC） • 手性色谱法（chiral chromatography；CC） • 胶束色谱法（micellar chromatography；MC） • 电色谱法（electrochromatography；EC）

8. 二、化学键合相色谱法 • 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC) • 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相

9. 优点： • 固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长； • 柱效高；重现性好； • 能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高 正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）键合相色谱法： 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱

10. （一）正相键合相色谱法 • 固定相：极性键合相 • 如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶） • 流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 • 如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂） • 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 • 如一些在硅胶柱上分离的物质

11. 正相键合相色谱法 • 分离机制？ • 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 • 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用 • 分离选择性： • 极性强的组分k大，后洗脱出柱。 • 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。

12. （二）反相键合相色谱法 • 固定相：非极性键合相 • 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 • 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂 • 常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）

13. 保留机制 疏溶剂理论（solvophobic theory） 溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。 不是溶质分子与键合相间的色散力，

14. 反相键合相色谱法 • 保留行为的主要影响因素 • 1、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 • 2、固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。

15. 反相键合相色谱法 • 保留行为的主要影响因素 • 3、流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 • 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 • 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 • 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 • pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。

16. 反相键合相色谱法 • 离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC ） • 用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。 • 适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱

17. （三）反相离子对色谱法paired ionchromatography；PIC ion pair chromatography；IPC • 把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。

18. BH B + H+ RSO Na RSO + Na+ ) BH RSO BH RSO m 离子对 + B A ( B A A s m 反相离子对色谱法 流动相 固定相 • 离子对模型 + + 3 3 + + ( ) ( 3 3 s 通式 + + + ( ) ) B

19. 影响容量因子的因素 • 离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大 • 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大 • 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。

20. 适用范围和离子对试剂的选择 • 适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。 • 分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等 • 分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）、

21. 第二节　高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择第二节　高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 • 固定相应符合下列要求： • 颗粒细且均匀； • 传质快； • 机械强度高，能耐高压； • 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。

22. 一、化学键合相色谱法的固定相 （一）键合相的种类 • 非极性键合相 ： • 非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； • 用于反相色谱； • 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。

23. 键合相的种类 • 弱极性键合相： • 醚基和二羟基等键合相 • 用于反相或正相色谱 • 极性键合相： • 常用氨基﹑氰基键合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)键合硅胶 • 一般用于正相色谱 • 特殊用途的键合相

24. （二）键合相的性质和特点 • 键合反应 • 硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应 如：YWG－C18H37，无定形硅胶YWG上键合了 十八硅烷基；Spherisorb ODS，球形硅胶 Spherisorb 上键合了ODS。

25. 键合相的性质和特点 • 键合相的性质 • 含碳量：含碳的百分数 • 覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例 • 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。

26. 键合相的性质和特点 • 键合相的特点 • 使用过程中不流失； • 化学稳定性好； • 适于梯度洗脱； • 载样量大 • 注意： • 流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH范围的键合相)。

27. 二、化学键合相色谱法的流动相 • 对流动相的要求： • 与固定相不发生化学反应。 • 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内， • 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。 • 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱压，提高柱效。

28. （一）流动相对分离的影响 • n由色谱柱（固定相）性能决定， • α主要受溶剂种类的影响， • k受溶剂配比的影响。

29. （二）流动相的强度和选择性 • 溶剂的极性（强度） • 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 • 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 • 溶剂的选择性 • 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 • 混合溶剂（二元或多元流动相）

30. 三、分离条件的选择 • （一）HPLC中的速率理论 • 涡流扩散A=2λdp • 球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。 • 纵向扩散β=2γDm 可以忽略。 • 因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳，

31. HPLC中的速率理论 • 传质阻抗 • 固定相传质阻抗CS可以忽略 ，因df极小 • 流动相传质阻抗Cm • 要求： dp小，Dm大

32. HPLC中的速率理论 • 静态流动相传质阻抗 ： • 由于部分流动相在固定相微孔内的滞留 • 静态流动相传质阻抗系数Csm • Csm ∝dp2， Csm ∝1/Dm，而Dm∝T/η • 要求: 固定相dp2、 流动相η都小

33. HPLC中的速率理论 H=A+Cmu+Csmu • 原因：化学键合相，液体流动相 • 结果：HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。

34. （二）正相键合相色谱法的分离条件 • 固定相 • 极性键合相　如氰基、氨基键合相等 • 流动相 • 烷烃加适量极性调节剂

35. （三）反相键合相色谱法的分离条件 • 固定相非极性键合相如ODS • 流动相以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂 • 弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂 • 加入0.1%∽1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用

36. （四）反相离子对色谱法的分离条件 • 固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相， • 离子对试剂 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反 • 流动相pH　使试样组分与离子对试剂全部离子化 • 有机溶剂及其浓度 同一般HPLC

37. 第三节　高效液相色谱仪 • 组成 • 输液系统 • 进样系统 • 色谱柱系统 • 检测系统 • 数据记录处理系统

38. 一、输液系统 • 高压输液泵 • 恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵 • 双泵：为了克服流量的脉动。 有串联式和并联式

40. 输液系统 输液泵应具备的性能： • 流量精度高且稳定 • 流量范围宽 • 能在高压下连续工作 • 液缸容积小 • 密封性能好，耐腐蚀

41. 输液系统 输液泵操作注意事项： • 防止固体微粒进入泵体 • 流动相不应含有腐蚀性物质 • 防止溶剂瓶内的流动相被用完 • 不超过规定的最高压力 • 流动相一般应该先脱气

42. 二、分离和进样系统 • 进样器 • 进样阀（六通阀）、自动进样装置 • 色谱柱（column） • 由柱管和固定相组成 • 分析柱、制备柱 • 性能评价 • H、n、fs、k和α的重复性，或R。

44. 三、检测系统 • （一）检测器(detector)的主要性能 • 要求： • 灵敏度（sensitivity）高（检测限低） • 噪音（noise）低 • 线性范围（linear range）宽 • 重复性（repeatability）好 • 适用范围广（通用型、专属型）

45. （二）紫外检测器(ultraviolet detector) • 检测原理： • 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl • 特点： • 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。 • 局限： • 只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。 • 专属型、浓度型检测器

46. 紫外检测器 • 固定波长检测器 ：254nm • 可变波长检测器： • 光源：氘灯（和钨灯）， 200—400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管 • 光路系统和紫外分光光度计相似 • 光电二极管阵列检测器 (photodiode array detector； PDAD)： • 一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光

48. 紫外检测器 • 光电二极管阵列检测器 • 工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱－色谱图。 • 用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。

50. 紫外检测器