SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

1. SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ IVlasta Němcová,Michael Jelínek,Jan Šrámek

2. Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocídvou metod: • detekce přímo v buňkách- fluorescenční barvení • detekce po izolaci a následné separaci proteinů- SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)

3. METODA 1:Fluorescenční barvení –detekce F-aktinu, G-aktinu a DNA • F-aktin:phalloidinkonjugovaný s TRITC • G-aktin:DNáza I konjugovaná s Alexa Fluor 488 • DNA:DAPI • použité buňky – buněčná linie NES2Y(lidské -buňkyLangerhansových ostrůvků)

4. Fixace – první krok přípravy vzorku • brání rozkladu a autolýze tkáně • cíl - zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín) • vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni • rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet • tkáň se stává rigidnější (snazší manipulace)

5. Pracovní postup: • fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) • odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS • inkubace buněk s phalloidinem-TRITC a DNázou I-Alexa Fluor 488 • odstranění nevázanéhophalloidinu-TRITC a DNázy I-Alexa Fluor 488 pomocí opakovaného promytí v PBS • barvení DNA pomocí DAPI • pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

6. METODA 2:Porovnání zastoupení aktinu v různých typech tkání pomocí metody SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)Izolace proteinů z různých typů tkání • použité typy tkání: • sval • srdce • játra

7. Izolace proteinů z tkáně: • prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk • dezintegrace (lýza) buněk působením: • chemickým(používáme v našich experimentech) • mechanickým • fyzikálním

9. Pracovní postup: Izolace proteinů • přenos tkáně do zkumavky • dezintegrace buněk pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát) • oddělení směsi proteinů od nezlyzované tkáně centrifugací Stanovení koncentrace proteinů • pomocí metody podle Bradfordové • použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu nezbytného pro vytvoření kalibrační křivky

10. Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE • povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícímSDS • nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinůna polyakrylamidový gel • separace proteinů pomocí vertikální elektroforézy Identifikace proteinů • barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku CoomassieBrilliant blue • lokalizace aktinu a ostatních proteinů v gelu, porovnání míry exprese v jednotlivých tkáních • chemiluminiscenční detekce aktinu (pouze demonstrace)

11. Stanovení koncentrace proteinů • používány různé metody • všechny uvedené metody jsou založené na spektrofotometrickém stanovení (měření absorbance) • metoda podle Bradfordové(námi použitá metoda) • Lowryho metoda • BCA metoda (Bicinchoninová metoda) • stanovení z UV spektra, atd.

12. Stanovení koncentrace proteinů metodou podle Bradfordové • příprava standardů pro sestavení kalibrační rovnice – několik vzorků proteinu o známé koncentraci (jako standard obvykle používán bovinní sérový albumin = BSA) • naředění lyzátu (koncentrace v rozsahu kalibrační přímky) • inkubace standardů a našich vzorků o neznámé koncentraci s činidlem Bradfordové • změření absorbance (A595 nm) • konstrukce kalibrační přímky • zjištění koncentrace proteinů v lyzátu výpočtem z rovnice kalibrační křivky

13. Princip metody Bradfordové • kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny • Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech(arginin (ARG), fenylalanin (PHE), tryptofan (TRY) a prolin (PRO))

14. Coomassie Brilliant Blue • po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou • detekce při 595 nm

15. Kalibrační křivka

16. Lowryho metoda • založená na detekci některých aminokyselin (tyrosin a tryptofan) • modré zabarvení roztoku (v závislosti na zastoupení obou aminokyselin ve vzorku) je detekováno při 500-750 nm

17. Stanovení z UV spektra • stanovení koncentrace proteinů pomocí absorpce v UV spektru (260 - 280 nm) • závislé na přítomnosti aromatických aminokyselin v proteinech (tyrosin a tryptofan) • [Protein] (mg/mL) = 1.55*A280 - 0.76*A260

18. BCA metoda • BCA = bicinchoninic acid • barevná reakce založena na interakci s peptidovou vazbou • purpurové zbarvení detekovatelné při 562 nm