Szabályozás

1. Szabályozás Transzkripció, transzláció, enzimaktivitás, fehérje koncentráció, efektor molekulák

2. Szabályozó útvonalak prokariótákban

3. A szabályozás elsődlegesen a transzkripciónál A prokarióta gének operonokba szerveződnek A gének megnyilvánulását promóterek vezérlik

4. A DNS függő RNS polimeráz (RNAP) felismeri a promótert és elkezdi a transzkripciót Iniciáció RNS polimeráz (core enzim) + szigma faktor (sokféle; specifikusság)

5. Az mRNS transzkriptum szinézise (5’3’); komplementere a templát szálnak– szigma disszociál Elongáció

6. Az elongáció addíg folytatódik, míg az RNAP el nem éri a terminátort és disszociál

7. A transzkripció iniciáció: a RNAP holoenzim a promoterhez kapcsolódik holoenzim = RNAP core + σ faktor

8. A vegetatív (s70) promóter felépítése -a core promótert ismeri fel aσ faktor T T G A C A 69 79 61 56 54 54 T A T A A T 77 76 60 61 56 82 17 bp spacer (43) % gyakoriság A 47 -60 DSR UP Element -35 -10 +1 Core Promoter

9. Az iniciációs komplextől az elongációsig RNAP + RNAP RNAP RNAP Zártkomplex Nyitott komplex Elongációskomplex promóter

10. A KIegyensúlyi konstanssal írható le KI = RPC/(R + P) Ez az átmenet a “promoter clearance” a promóter felszabadulása - kIV A nyitott komplex képződés sebességét gyakran kII konstanssal A transzkripció iniciáció mechanizmusa NTP-ék k1 k2 k3 k4 RPC RPO RPI RPE R + P k-1 k-2 k-3 abortív transzkriptumok R – RNAP P – Promóter RPC – zárt komplex RPO – nyitott komplex RPI – iniciációs komplex RPE- elongációs komplex

11. A transzkripciós ciklus • Körfolyamatnak tekinthető • iniciáció • elongáció • termináció

12. AThermus aquaticus RNAP core enzim 3D szerkezete (ribbon diagram)

13. Mitől függ a gén transzkripciós aktivitása? Promóter erősség Mennyire hasonlítanak a promóter fő részei (-10,-35 boxokés a köztük levő távolság) a konszenzus szekvenciához? - általában minél inkább, annál aktívabb a promóter - de néhány hely sokkal fontosabb, mint a többi TTGACA ---17bp---TATAAT---A konszenzus TCGACA---17bp---TATTAT---A erős promóter TCAGTT---19bp---GATAAC---A gyenge promóter

14. A fő elemeken kívüli szekvenciák befolyásolják a promóter erősségét • Néhány promóternél hosszabb –10-esszekvenciák (cisz) • 2. UP elemek • más promótereknél a -35-ös boksz előtti AT gazdag szekvenciák növelik a transzkripció sebességét (cisz) • 3. Downstream elemek • közvetlenül a transzkripciós start hely utáni szekvenciák befolyásolhatják a transzkripció iniciációjának hatékonyságát (cisz) • Szabályozó fehérjék, vagy más effektor molekulák (transz)

15. A KI egyensúlyi konstanssal jellemezhető KI = RPC/(R + P) Ez az átmenet a „promóter tisztulása,” “promoter clearance”,akIVkonstanssal jellemezhető A nyitott komplex képződés sebessége kII Génszabályozás I – Transzkripciószabályozása NTP-k k1 k2 k3 k4 RPC RPO RPI RPE R + P k-1 k-2 k-3 abortív transzkriptumok

16. Két lépés a szabályozott gén-megnyilvánuláshoz • 1. σ faktor választék – megszabja, hogy melyik promoter legyen be-, vagy kikapcsolva. • Szabályozó fehérjék – általában DNS-kötő fehérjék • a. Represszorok – gátolják a transzkripciót • b. Aktivátorok – növelik a transzkripciót • c. Kettős hatású szabályozók – mindkettőt – a körülményektől függően

17. A transzkripció inicációjának kezdete: RNAP holoenzim kötődik a promóterhez holoenzim = RNAP core (α2ββ’) + σ

18. A vegetatív (s70) promóter felépítése -a core promótertismeri fel a σ faktor T T G A C A 69 79 61 56 54 54 T A T A A T 77 76 60 61 56 82 17 bp spacer (43) % gyakoriság A 47 -60 DSR UP elemek -35 -10 +1 Core promóter DSR = downstream regulátor elemek

19. Alternatív σ faktorok Különböző szerkezetű promótereket ismernek föl – gének különböző regulonjai

20. Az különböző σ faktorral szabályozott promótereknek teljesen eltérő konszenzus szekvenciája lehet s70 TTGACA – 17 bp – TATAATN3-6-A -35 -10 s32 CTTGAAA – 16 bp – CCCCATNTN3-10-T/A -35 -10 s54 GG – N12 – GC/T – 12bp – A -24 -12

21. Egy adott pillanatban a legtöbb RNAP s70 –es, de néhány százalékban más σ faktor is van

22. A legtöbbs faktor as70–es családhoz tartozik és ezért a σ70 –hez hasonlóan működik A s54eltérő – a kötödés után egy aktívátor fehérjének kell aktiválni – kII–őt befolyásolja – RPOképződik

23. Hogyan tudja egy anti-σ faktor a diferenciális génszabályozást biztosítani? Példa: egy anti-σ faktor az FlgM(FlgM – s28)

24. Transzkripciós faktorok Általában DNS-kötő fehérjék, amelyek asszociálnak a szabályozott promóterrel és csökkentik, vagy növelik a transzkripció gyakoriságát. Represszorok és aktívátorok –a szabályozó fehérjék jó része mindkettőt tudja a körülményektől függően

25. A represszorok eltérő szabályozási mintázatokat juttathatnak érvényre Arginin bioszintézisLaktóz degradáció Indukció Represszió

26. A represszió,vagykorepresszió mechanizmusa Példa: arginin, a 20 aminosav egyike A baktériumok el tudják készíteni maguknak, de ha arginint adunk a táptalajhoz, nem működtetik a bioszintézis géneket (nem nyilvánulnak meg) (A fene se dolgozik, ha van kaja bőven!) Nincs arginin Kell a sejtnek A represszor nem kötődik Az arginin gének megnyilvánulnak Sok az arginin Elegendő a sejtnek Represszor + Arg kötődik Az arginin gének csendesek Arginin Represszor, korepresszor, effektor, operátor

27. Egy indukálható repressziós mechanizmus Példa: laktóz, cukor szénforrás a baktériumok hasznosítani fogják a laktózt, ha az van a tápközegben, de nem működtetik az ehhez szükséges géneket, ha nincs (Miért gyártsuk le az enzimeket, ha nincs is laktóz?) Nincs laktóz A sejt nem hasznosíthatja A represszor kötődik a lac operátorhoz Lac enzimek nem képződnek Van laktóz Tápanyagként hasznosíthatják [Represszor + allolaktóz]leválik a DNS-ről A Lac enzimek gyártása elkezdődhet Lactose

28. A transzkripciót aktíváló mechanizmus Példa: maltóz, cukor szénforrás A baktériumok hasznosítják a maltózt, ha van, de a gének nem nyilvánulnak meg, ha nincs (Miért készítsük el a maltóz hasznosításához szükséges enzimeket, ha nincs a környezetünkben? – a lac-hoz hasonló logika) Van maltóz Tápanyagként hasznosíthatják a sejtek [Aktívátor+maltóz] kötődhet a DNS-hez Készülnek a Mal enzimek Nincs maltóz A sejtek nem Az aktívátor nem kötődhet a DNS-hez Nincs Mal enzim szintézis Gyenge promóter maltóz Aktívátor fehérje, iducer, aktívátor-kötő hely

29. Hova kötődnek a szabályozó fehérjék a promótereknél? Az aktívátorok általában -30-as hely előtt (upstream) kötődnek; míg sok represszor utána (downstream), valamint a -30-as boksz előtt is kapcsolódhat a DNS-hez

30. Represszió, gátló mechanizmusok • Térbeli gátlás (steric hindrance) – a kötőhely átfed a promóterrel és és a represszor kötődés affinitása nagyobb, mint a RNAP-é (KI) • Fehérje-fehérje kölcsönhatások – a represszor megakadályozza a RNAP kötődése utáni lépéseket (kIIéskIV) • RNSpolimerázbezárása – a represszor megváltoztatja a lokális DNS szerkezetet és így limitálja a kötődött RNAP produktivitását (kIIéskIV) • Összetett (multipartite) promóterekés DNS kihurkolás(DNA looping) – összetett represszorok kötődnek különböző helyeknél, megváltoztatva a DNS konformációját és befolyásolják a RNAP kötődését (KI)

31. l l l l A lrepresszortérbeli gátlással akadályozza PRaktivitását Lítikus funkciók -10 -35 -35 -10 Lizogén funkciók OR3 OR2 OR1 PRM PR

32. A legtöbb represszor sokkal komplikáltabb – a LacI represszor is Az összetett operátorok és a DNS looping is gyakori További fehérjék (mint pl. a CAP és a CytR) is gyakran szerepelnek

33. A transzkripció aktíválásának néhány mechanizmusa Szinte mindig szükséges a RNAP-al való kontaktus Nagyon jó példa a katabolit represszió – a katabolit aktivátor fehérje (catabolite activator protein) (CAP) Ez„globális” szabályozó – több mint 100 promótert szabályoz

34. A CAP a cAMP-vel kapcsolódva aktíválódik(cAMP intracelluláris koncentrációja nő, ha a glükóz elfogy) A fehérje dimerizálódik és különböző módon kötődhet a promóterekhez – és nagy mértékben meghajlítja a DNS-t (DNA bending) I. – a -35 box előtt II. – átfeda –35–ös régióval A RNAP-pal érintkezve stimulálja a transzkripciót Class I Class II

35. A promóter aktíválás I. és a II csoportjának modelljei Az I. csoportban a CAP kötőhelyek -62-től -103-ig terjedhetnek. A CAP a RNAP α-alegységének C-terminális (αCTD)részével lép kölcsönhatásba A II. csoportban a CAP kötőhelye általában átfed a -35-ös régióval. A CAP kölcsönhat azaCTD-vel, aNTD-velés a s faktorral is

36. Az AraC szükséges az ara gének aktíválásához További adatok szerint az AraC kapcsolódik egy a PBAD promótere(az araBAD gének promótere) előtti távoli araO2 operátorhoz és ekkor gátolja a PBADaktivitását.

37. Regulátorok aktívátor és represszor aktivitással Az arabinóz katabolizmus regulátora az AraC jó példa erre Sok gén vesz részt a felvételében és a katabolizmusában

38. Az AraC-től függő szabályozás Összetett repressziós loop Transzkripciós aktívátor I. csoport • araC-PBADkazetta kereskedelmi forgalomban • Szigorú represszió arabinóz nélkül (és glükóz jelenlétében) • 2. Arabinóz hozzáadásával erős aktíválódás

39. A s54–től függő aktíválás mechanizmusa ( a jó öreg σ) Az NtrC transzkripciós aktívátorral való kölcsönhatással – egy enhancer típusú fehérje NtrC stimulálja a s54 RPOképződést – így befolyásoljakII-őt

40. A regulátorok a RNAP különböző komponenseivel lépnek kölcsönhatásba

41. Szabályozási útvonalak prokariótákban

42. A transzkripció terminációja a szabályozás fontos célpontja lehet

43. A transzkripció sok gén esetében a kódoló szekvenciák után fejeződik be

44. A trp mRNS upstream regiójának több lehetséges másodlagos szerkezete lehet, az egyik transzkripiós terminátor

45. A triptofán bioszintézise többszörösen szabályozott - Egyszerű korepressziós mechanizmus a triptofánra adott válasz – a regulátor a TrpR triptofán + TrpR TrpR A trp operon expressziója – trpEDCBA A trpR null mutánsban a trp gének nem működnek konstitutívan.Van valamennyi triptofán represszió.

46. Ennek a szekvenciának a deléciója megszüntette a TrpR-től független repressziót A gén szekvenciájának elemzése érdekes tulajdonságot fedett fel

47. A transzkripció attenuációjának mechanizmusa • RNAP megpihen az 1:2 hajtű szintézise után • 2a. A riboszóma elkezdi a leader transzlációját – áthalad a Trp kodonokon (sok Trp) • 2b. A riboszóma elkezdi a leader transzlációját – a Trp kodonoknál megáll (kevés a Trp) • 3a. A riboszóma befejezi a leader peptidet – a 3:4 hajtű kialakul • 3b. Az álló riboszóma megakadályozza 1:2 kialakulását – helyette 2:3 képződik • 4a. A RNAP terminációját a 3:4 hajtű kialakulása okozza • 4b. A 3:4 hajtű nem tud idejében kialakulni, a RNAP átírja a lehetséges terminátor helyet

48. A transzláció attenuációja Gyakran az antibiotikum rezisztencia géneknél – néhány antibiotikum célpontja a riboszóma. Egy egyedi mRNS szerkezeten és egy leader peptiden alapul

49. mRNSmásodlagos szerkezete lefedi a riboszóma-kötő helyet A transzláció várakozása a vezető-peptidnél megtöri a másodlagos szerkezetet és lehetővé teszi a transzlációt

50. Proteázok befolyásolhatják a fehérje aktivitásának szabályozását A fehérje funkció szabályozása a stabilitásával