Purificación de proteínas Parte II 20 Agosto, 2013

1. Purificación de proteínas Parte II 20 Agosto, 2013

2. Purificación de proteínas Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés

3. Empezar a separar Métodos de Baja resolución Precipitación con sales, solventes, temperatura o pH Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante Métodos de Alta Resolución

5. Sal más usada: Sulfato de Amonio Propiedades

7. Solubilidad de las proteínas en Sulfato de Amonio Fibrinogeno Mioglobina

8. Lactato deshidrogenasa 1.1.1.27

12. Homogenización • 100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo) • Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.) • Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0) • Centrifugar a 7,000 rpm 4° C 10 min. • Decantar sndnte y tomar fracción 1 mL (F1) • Guardar fracciones a -20°C • Precipitación por salado • 25 mL del sndnte en vaso de pp. • Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio (55 % de saturación) • Centrifugar a 4°C a 10,000 rpm 10 min. • Registrar volumen y tomar 1 mL fracción 2 (F2) Guardar a -20°C • Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y 3 • Descartar el sndante • Resuspender botón o pellet en 1 mL de agua • Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20°C

14. Carga pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación. pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble

15. Cromatografía Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes. Muestra aplicada Eluyente Volumen de columna Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

16. Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna. Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

17. kDa MASA Å Å TAMAÑO

18. Cromatografía de exclusión molecular PRINCIPIO: • Tamaño de partícula y masa molecular. • Mayor masa molecular eluye primero • El gel retiene particuas de menor masa molecular

19. APLICACIONES • Desalado de proteínas • Purificación de proteínas • Determinación del peso molecular de las proteínas TIPOS DE MATRIZ GRANULOS DE UN MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO • Dextranos con enlaces cruzados • Agarosa • Poliacrilamida

20. FASE ESTACIONARIA En esta práctica se utilizará el gel dextrano.

21. Las proteínas son moléculas cargadas • De • Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos • Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea

22. Cromatografía de intercambio iónico

23. Intercambio catiónico Fase estacionaria cargada negativamente Intercambio aniónico Fase estacionaria cargada positivamente

24. GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

26. Factores que afectan a la retención • Fuerza Iónica 2. pH 3. Modificadores Orgánicos

27. Reconocimiento molecular

28. Cromatografía de Afinidad

29. Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.

31. Ejemplo: Proteínas con poli-His

32. Unión por afinidad y desalado

33. IOJAP Pur. Prot. Pur. Prot. Pellet Wash Flow Pellet Wash Flow kDa 75 50 37 25 W. Succinogenes 30 kDa M. Genitalium 28 kDa

34. VENTAJAS: • No hay restricción por volumen. • Especificidad • Pureza del producto final • DESVENTAJAS: • Precio (alto) • Condiciones de elución drásticas • Ligando específico no disponible o inadecuado

35. Desalado

36. Determinación de la concentración de proteína Métodos espectrofotométricos Ventajas de la técnica Rápida Precisa Versátil Fácil de usar Eficiente en costo

39. Ir constryendo su tabla de purificación...