FISH – fluorescence in situ hybridization –

1. FISH FISH – fluorescence in situ hybridization – цитогенетический метод, используемый для детекции и локализации специфических последовательностей ДНК на хромосомах, мРНК и др. В основе методики лежит гибридизация флюоресцентно меченого ДНК/РНК зонда с комплементарной последовательностью ДНК/РНК. Выявление метки происходит с помощью флюоресцентного микроскопа. Метод FISH был введен более 30 лет назад (в 1980-х гг.). Он широко распространился как метод физического картирования генов на хромосомах. Позднее он стал применяться в других областях исследований (в областях клинической генетики, нейронауки, репродуктивной медицины, токсикологии, микробной экологии, эволюционной биологии, сравнительной геномики, клеточной геномики и хромосомной биологии). На данный момент FISH преимущественно используется для построения физических и генетических карт хромосом, для выявления структурных перестроек, транслокаций, микроделеций, генных амплификаций в интерфазных и метафазных хромосомах. В результате развития науки (лучшего понимания химических и физических свойств нуклеиновых кислот и хроматина), а также развития флюоресцентной микроскопии и цифровой визуализации, метод постоянно совершенствовался (произведено улучшение чувствительности, специфичности, разрешения), и было разработано много вариаций данного метода.

2. 3) The probe and chromosomes are denatured, hybridised then washed 1) Cells are dropped on to a glass slide causing chromosomes to spread 2) Fluorescently labeled probe is placed on chromosomes and sealed. 4) Chromosomes are counter stained using DAPI 5) Slide is viewed under a fluorescent microscope

3. DNA polymerase I removes individual bases from the 5’ end DNase nicks DNA DNA polymerase I adds new nucleotides to the 3’ hydroxyl  • Зонды:одноцепочечные/двуцепочечные ДНК/РНК первично/вторично меченые зонды. • Зонды метятся: • напрямую: путем вставки нуклетидов, к которым прикреплен флюорохром (ПЦР или nick translation) • через репортерную молекулу (пр: digoxigenin, biotin) к которой крепятся флюоресцентно меченые антитела. Для усиления сигнала можно использовать вторичные, третичные и т.д. антитела, меченые флюоресцентной меткой. Nick Translation Визуализация хромосом: c помощью DAPI (2mg/ml). 4’,6-diamidino-2-phenylindole; сильное связывание с A-T богатыми участками ДНК;возбуждение UV светом; эмиссия 461nm (blue).

4. Вариации FISH • 1) Q-FISH – quantitative FISH: • Разработан Lansdorp et al: U.M.Martens, J.M. Zijlmans, S.S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E.A. Chavez, R.K.Ward, and P.M. Lansdorp. 1998. Short telomeres on human chromosome 17p. Nat. Genet. 18:76-80. • Количественный метод. • Разработан для работы с проточной цитометрией. • Изначально применялся для измерения длины хромосом (разрешение: 200 bp) путем подсчета числа теломерных повторов. • Используются PNA-конъюгированные зонды. • Изначально исследовали метофазные хромосомы (собственно Q-FISH), теперь данный метод применим и для интерфазных хромосом (IQ-FISH). • Q-FISH проводится на культуре клеток, срезах тканей (оба на стеклах). • На данный момент Q-FISH является важным инструментом в изучении роли теломеров в процессах старения и ракообразования.

5. 2) PNA-FISH – Peptide nucleic acids FISH: • Пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs) – синтетические аналоги ДНК, в котором сахарный остов фосфата дезоксирибозы, поддерживающий азотистое основание, заменен на незаряженный пептидный остов. • В результате такой структуры: при гибридизации PNA-олигомерного зонда с комплементарной ДНК/ РНК не происходит электростатического отталкивания. • PNA-DNA (PNA-RNA) дуплексы гораздо стабильнее натуральных гомо-/гетеродуплексов. • Высокая специфичность связывания PNA-DNA:PNA-DNA гибридизация намного чувствительнее в отношении несоответствия пар оснований, чем DNA-DNA гибридизация. Так, с помощью PNA-зонда можно различить два центромерных повтора, различающиеся всего по одной паре оснований. • PNA обладает относительной гидрофобностью (по сравнению с DNA), вследствие чего PNA лучше диффундирует сквозь клеточные стенки => широкое применение в микробиологии. • На основании высокой специфичности связывания: считается, что PNA технология в скором времени станет основой для создания аллель-специфичных зондов для in situ гибридизации. • Применяется в генетике, цитогенетике, эпигенетике, микробиологии и др.

6. 3) Flow-FISH – FISH for flow cytometry: • Предложен в 1998 г.: Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P.M. Telomere • length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flowcytometry. Nature Biotechnol. 16, 743–747 (1998). • Комбинация Q-FISH и проточной цитометрии, позволяющая анализировать (измерять) сигнал и сортировать. • Для flow-FISH используется клеточная суспензия (для измерение длины теломеров хромосом), хромосомные спреды и выделенные хромосомы (для дальнейшего картирования). • Как и в Q-FISH, используются PNA-меченые теломерные зонды (например, для визуализации и измерения длины теломерных • повторов) • Главное преимущество – более быстрый метод (анализ/сортировка большого количества клеток/хромосом). • Широко применяется для исследования разных проблем: старения, сохранение теломер, исследование суспензий гемотопоетических стволовых клеток ex vivo, исследование бактерий. Multiparametric analysis allows for differentiation of cell types within one sample, allowing for internal control, and analysis of leukocyte subtypes.

7. Преимущества flow-FISH: • Легко воспроизводимый результат • Возможность анализировать подгруппы клеток в популяции, используя физические и иммунофлюоресцентные маркеры • Лучшая производительность, чем в Q-FISH • Возможность получать количественные данные по флюоресценции тысяч клеток

8. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ХРОМОСОМ с помощью методов проточной цитометрии 1. Сортировка хромосом с помощью проточной цитометрии • - Кариотипирование с помощью проточной цитометрии используется для дальнейшего картирования генов и построения хромосомных библиотек. • Идентификация и локализация генов на сортированных хромосомах производится с последующим применением мотодов FISH/ метода PRINS (primed in situ labeling) или его вариаций и хромосом-специфической ПЦР. • К 2011г. успешно сортированы пока только хромосомы 17 видов культивированныхрастений. • Сортировка метафазных или пахитенных хромосом с высоким индексом деления. • Флюоресцентная метка: • Хромосомы метятся флюорохромами, специфичными к нуклеиновым кислотам. • Флюорохромы выбираются в соответствии 1) со специфичностью к азотистыми основаниями, 2) с условиями эксперимента (в том числе учитывая длины волн имеющихся лазеров). • 1. Для моновариантного анализа используюткраски, не специфичные к A-T или G-C парам: • propidium iodide (пик возбуждения: 535 нм, эмиссии: 617нм, требуемый лазер: 488нм-аргоновый лазер или лампа + long-pass filter) • ethidium bromide (пики возбуждения: 300 и 520нм, эмиссии: 600 нм, требуемый лазер: 488нм-аргоновый лазер или лампа+ long-pass filter) • Данные метки красят ДНК не зависимо от содержания A, G, T или C-азотистых оснований. • 2. Для бивариантного анализа используют: • chromomycin A3 (специфичен для G-C пар оснований), пик возбуждения: 458нм, эмиссии 580 нм. Лазер:, 458нмминимум 400 мВ мощность. • Hoechst 33258 (специфичен для A-T пар оснований), возбуждение: 351-364нм, эмиссия: 470нм. Лазер: 351-364нм (мощный). • Лазеры должны быть разделены во времени и пространстве из-за частичного перекрытия спектров флюорохромов.

9. 2. Исследование хромосом/ нуклеотидных последовательностей после сортировки (для построения физических и генетических карт и т.п.) • FISH • BAC-FISH • PRINS • C-PRINS FISH • Исследование больших геномов с длинными хромосомами. • Картирование последовательностей с большим количеством повторов (пр: теломерных и центромерных участков). • Использование коротких зондов. • Благодаря большому количеству повторов сигнал сильный. • Стандартная величина зонда: 15 – 30 нуклеотидов.

10. Проблемы FISH: • Сложно локализовать однолокусные последовательности ДНК (т.е. неповторяющиеся уникальные последовательности ДНК), т.к. при использовании стандартных коротких зондов сигнал будет очень слабым. • Увеличение длины зонда до неск. килобаз для усиления сигнала приведет к снижению чувствительности и => к неспецифическому связыванию. • Решение: BAC-FISH. BAC-FISH - BAC-FISH – комбинация метода FISH и использования клонов геномной ДНК, встроенной в бактериальные искусственные хромосомы (BAC), позволяющие встраивать большие последовательности ДНК. - Эффективный метод для идентификации и картирования отдельных хромосом организмов с небольшими геномами. В качестве зонда используется BAC-зонды, overgos (overlapping oligonucleotides).

11. Альтернатива FISH: PRINS • PRINS (primed in situ labeling) – способ мечения хромосом с помощью отжига олигонуклеотидного ДНК-праймера с гомологичной последовательностью денатурированной хромосомной ДНКи последующего энзиматического удлинения праймера in situ мечеными нуклеотидами. • Впервые описан Koch et al. в 1989г. (Koch, J. E., Kølvraa, S., Petersen, K. B., Gregersen, N., and Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming methods for the chromosome-specific labelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma 98, 259–265). • PRINS является альтернативой FISH. • Применяется для локализации нуклеотидных последовательностей, распознавания и подсчета метафазных или интерфазных хромосом или хромосомных пар (в т.ч. хромосомной анеуплоидии). отжиг немеченого праймера (праймер – затравка) с исследуемой ДНК элонгация затравки с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и меченых нуклеотидов • Праймер: • фрагмент рестрикции • ПЦР-продукт • олигонуклеотид остановка реакции (присоединение блокирующей молекулы на 3’-конец) • Мечение нуклеотидов: • прямое (флюорохромами) • непрямое (biotin/ dig  флюорохром-конъюгированный avidin/anti-dig) • В результаты каждой PRINS реакции можно идентифицировать только одну пару гомологичных хромосом (одну хромосому). Следующую реакцию PRINS на том же стекле можно проводить только после блокировки предыдущей. • Применяется для последовательностей ДНК с большим количеством повтором.

12. Преимущества PRINS: • Требуется минимальная информация о последовательности, требуемая для синтеза олигонуклеотидногопраймера. • Наиболее быстрый и простой метод детекции интересующей нас последовательности на хромосоме (по сравнению с использованием тяжелых зондов для FISH, гибридизующихся очень большой промежуток времени). • Исключение стадии мечения зонда. • Возможность элонгироватьпраймер мечеными нуклеотидами для усиления сигнала при детекции коротких уникальных последовательностей. c-PRINS Для выявления малокопийных повторов или коротких уникальных последовательностей применяется более чувствительный метод – cycling PRINS (c-PRINS). C-PRINS предложен Gosden et al. в 1991г., улучшенный широко используемый протокол – Kubaláková et al., 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001).Localisation of DNA sequences on plant chromosomes usingPRINS and C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71-82). C-PRINS включает в себя серию термальных циклов, аналогичных ПЦР.

13. Sheath fluid for FISH: • BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) • 40 mM KCl + 10mM NaCl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting of mitotic chromosomes in common wheat (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000;156(4):2033-41) • MgSo4 buffer without dithiothreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Flow-sorted chromosomes: a fine material for plant gene physical mapping. Caryologia. 2006, vol.59, №2:99-103) • autoclaved 0.1% (wt/vol) NaCl • 50 mM NaCl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005, 170(2): 823–829) • Chromosome-stabilizing polyamine buffer (protein-containing sheath fluid) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)