340 likes | 1.47k Views
In situ Hibridizasyon (ISH). Gemisi 30 yildan daha fazlaya dayanan bir yntemdir, Sitolojik preparatlarda, genlerin veya DNA dizilerinin kromozomlar zerinde direkt yerlesimine olanak tanir. Son 15 yil iinde yardimci floresan tekniklerin gelismesiyle birlikte, bu teknigin uygulanmasinda bir ar
E N D
1. In situ Hibridizasyon (ISH, FISH, GISH, CGH) Fatma Elif Çepni, Aslihan Temel,
N. Özer Senol, Baris Eren,
Murat Pekmez, Özgür Çakir
2. In situ Hibridizasyon (ISH)
3. Tek bir nukleusla temsil edilen farkli türlerden köken alan kromozomlarin ayirimina dayanan bir yöntemdir.
Somatik hibritlerin mayozu ve geri çaprazlama sonucu elde edilen hibritlerin çalisilmasinda kullanilabilir.
Uygulama alani genellikle hibritlerdeki ebeveynlerin kromozom analizidir.
Çok sayida dogal alloploid hibritlerde ve türler arasi hibritlerde kullanilmistir.
ÖR: domates-patates (Jacobsen et al. 1996),
Allium cepa- A. fistulosum (Khrustaleva and Kik, 1998), Alstroemeria aura- A. inodora (Kamstra et al. 1999)…
4. FISH Moleküler sito-genetikteki hizli ilerlemeler, bantlama ve boyama tekniklerinin hizli gelisimiyle saglanmistir.
Standart bantlama teknikleri yalnizca bir denemede bir hücre için tüm genomu sorgulamada yetersiz kalmaktayken,
Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH), genleri ve kromozomlari boyamada fluoresan moleküllerin kullanildigi bir yöntem olarak bantlama teknikleriyle birlikte iyi bir degerlendirme aracidir.
6. FISH Fluoresan isaretleme, in situ hibridizasyon prensibine göre, prob ve örnek arasinda melez bir yapi meydana gelmesiyle sinyale dönüsen bir islemdir.
FISH, Southern blot tekniginin analogudur.
FISH, fluoresan isaretlerle etiketlenen, tamamlayici DNA’ya, bu DNA dizilerinin yerlesimini görebilmek için hibridizasyona ugrayan veya baglanan tek zincirli DNA (prob) kisa dizilerini gerektiren bir yöntemdir.
7. FISH Bu yöntem gen haritalanmasinda ve kromozom aberasyonlarinin tanimlanmasinda kullanilir.
Kromozomlarin çalisilmasinda kullanilan birçok teknik, aktif olarak bölünen hücreleri gerektirirken (metafaz kromozomlari),
FISH ayni zamanda bölünmeyen hücrelere de uygulanabilir (interfaz nukleusu).
Metafaz delesyonlari belirlemede kullanilir
Interfaz genelde kromozomlarin yeniden düzenlenmesinin ve kromozom sayilarinin belirlenmesinde kullanilir.
9. FISH Prob hazirlama
10. FISH “Whole chromosome” problari, herbiri tüm bir kromozom boyunca farkli dizilerle hibridizasyona girebilen küçük problarin kolleksiyonudur. Bu sekildeki bir prob kitapligi taranarak tüm bir kromozom spektral bir karyotip olusturmak üzere boyanabilir. Bu teknik kromozomal translokasyonlarin tanimlanmasinda imakan saglar
FISH ile sitogenetik çalismalara yardimci olan ve iyi tanimlanmis uygulamalar gelistirilmis olmasina ragmen, amaca uygun prob ve filtre seçimi dogru yapilmaz ise hatali ve zaman alici denemeler ortaya çikmaktadir
11. FISH Prosedür
Metafaz kromozomlari veya interfaz nukleusu kullanilarak preparatlarin hazirlanmasi
Etanol içinde dehidrasyon
DNA’yi 70oC’de denatüre etme
Etiketli probun denatürasyonu
Hibridizasyon için 37oC’de, 4-16 saat inkübasyon
12. FISH
13. FISH Spektral Karyotipleme
Herbiri 5 florokromun farkli kombinasyonlariyla hazirlanmis problarin 24 kromozomla hibridizayounu ve tek bir filtreye sahip flüoresans mikroskobu ile analizine dayalidir.
Kansere neden olan genomik degisikliklerin standart bantlama yöntemlerinden daha iyi anlasilmasini saglar.
M-FISH (Multicolor FISH)
5 florokromun çesitli kombinasyonlariyla hazirlanmis problarin hibridizasyonu ve farkli flouresans sinyalleri ile analizine dayali bir yöntemdir.
14. FISH COBRA-FISH
Diger FISH yöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom kullanilir. 24 kromozomun 12si bir gruba diger 12si diger gruba ayrilir. Ilk grup 3 florokromla hibridlestirilirken, 2. gruba ek olara dördüncü florokrom uygulanir.
Bu metod, 5. florokrom için, kollara özgü boyama veya M-FISH ile locus-specific proba geçis için kullanilmistir.
R x FISH
Gibbon kromozomlarinin prob olarak kullanilir. Gibbon ve insan kromozomlarinin homolojisi yaklasik % 98 dir.
RxFISH ile yalnizca kromozom arasi parça degisimleri degil, ayni zamanda kormozom içi degisimler de belirlenebilmektedir. (delesyon, inversiyon). G-bantlama teknigi ile birlikte kullanildiginda 400 kat daha hassas sonuçlar vermektedir.
19. FISH Kullanimdaki faydalari
Hizli
Hibridizasyon ve belirleme için yüksek etkinlik
Birçok hücre analiz edilebilir
Replikasyon geçiren hücrelerin kullanilmasi gerekmez
20. FISH Kullanimdaki sinirlamalar
Probun uygun olmasi ve dogru probun eldesi için nelere bakilmasi gerektiginin iyi bilinmesi
Hibridizasyon için birlesme sinyali
Nuklear organizasyonda beklenmedik varyasyonlar
22. CGH (Karsilastirmali Genomik Hibiridizasyon)
23. iki renkli görüntüleme sistemi kullanilmasi sonucunda kromozom anomalilerinin daha güvenilir saptanmasi
Az miktarlarda DNA örneginin yeterli olmasi
Test örnegi için metafaz kromozomlari gerekli degil
Kati tümörlerin çalisilmasinda da elverislidir.