Técnicas de Preservação de Microrganismos

1. Técnicas de Preservação de Microrganismos Lara Durães Sette CBMAI-CPQBA/UNICAMP lara@cpqba.unicamp.br

2. Importância da preservação • armazenamento de culturas por longos períodos e utilização periódica para pesquisa e/ou produção • contaminação • perda de viabilidade • mutação (perda das características fisiológicas) • solução → metodologia de preservação de longa duração • diminuição do crescimento e das atividades metabólicas • crescimento em meio mínimo • resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura

3. Importância da preservação • preservação a longo prazo • evita problemas com o novo isolamento de microrganismos • economia de tempo, mão de obra e custos com material de consumo • importante função da coleção de culturas • pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para preservação por períodos prolongados • garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza

4. Escolha do método de preservação • pontos a serem considerados • manutenção da viabilidade: perda de células no processo de preservação e durante o armazenamento • manutenção das propriedades originais: perda de características de interesse científico ou industrial • pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo • custos de preservação e manutenção

5. Escolha do método de preservação • tamanho estimado do acervo:tempo operacional exigido anteriormente e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento • importância do acervo:conseqüência de sua eventual perda; culturas com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método • necessidade de acesso e uso da cultura:réplicas em quantidades adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para embalagem de envio e condições de transporte • disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros

6. Métodos de preservação • curto prazo • repique contínuo • médio prazo • preservação em óleo mineral • preservação em água • congelamento a -20°C • secagem em sílica, solo e papel de filtro • longo-termo • liofilização • congelamento a -80°C • criopreservação em nitrogênio líquido

7. Repique contínuo • princípio • diminuição do metabolismo (meios mínimos; baixa temperatura) • fatores a serem considerados • meio adequado para manter a cultura • temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; geladeira (4 a 7 ºC) de 4-6 meses • freqüência entre as transferências: determinação empírica • minimizar o n° de repiques → evitar a seleção de mutantes • examinar a pureza em cada transferência • conservar em duplicata

8. Repique contínuo

9. Repique contínuo • vantagens • baixo custo • não requer equipamentos especializados • o manuseio é simples • desvantagens • riscos de contaminação e possível perda da linhagem • perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade • seleção de células atípicas (variantes ou mutantes) • supervisão especializada • mão-de-obra • espaço relativamente grande para a armazenamento

10. Preservação em óleo mineral e em água • princípio • diminuição da atividade metabólica • fatores a serem considerado (Castellani) • espessura do ágar • número de blocos na água

11. Preservação em óleo mineral Preservação em óleo • vantagens • ↓ custo de equipamento • evita contaminação por ácaros • desvantagens • necessidade de mais transferências • até que a cultura revigore • requer espaço para amazenamento armazenamento em geladeira

12. Geladeira Preservação em água (Castellani) Blocos de ágar de 4-6 mm3 10-15 mL água destilada esterilizada

13. Preservação em água armazenamento em geladeira Preservação em água • vantagens • boa taxa de viabilidade • evita contaminação por ácaros • desvantagens • limitado a organismos que • aderem ao ágar (Castellani) • dificuldade da retirada dos cubos • na reativação (Castellani) • crescimento durante a estocagem • requer espaço p/ amazenamento • riscos de contaminação

14. Secagem • princípio • diminuição do metabolismo por desidratação e conservação em geladeira • fatores a serem considerados • tipo de célula • idade da cultura • concentração celular • condições de estocagem

15. Secagem em sílica e em solo

16. Secagem em papel de filtro

17. Secagem • vantagens • simples e de baixo custo • não requer equipamento especial • estabilidade elevada • ácaros não sobrevivem • desavantagens • métodos limitados a bactérias e fungos filamentosos esporulados • risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo • papel: poucos dados sobre o sucesso do método

18. Liofilização • princípio • remoção da água por sublimação • fatores a serem considerados • tipo de células • idade da cultura • concentração celular • agentes crioprotetor • condições de estocagem • método de reidratação

19. Liofilização • agentes crioprotetores • reduzem danos durante o congelamento e descongelamento • estabilidade ao microrganismo contra os efeitos adversos da estocagem • leite desnatado (skim milk) 10% • leite desnatado 10% + inositol 5% • sacarose 7% + peptona 7% • inositol 5% em soro de sangue de cavalo

20. Maçarico Liofilizador Maçarico Cultura pura 0,2 mL na ampola 3 mL Skim Milk Liofilização

21. Liofilização - reativação

22. Liofilização • vantagens • vedação total da amostra • longa viabilidade • estabilidade elevada em muitas espécies • produção em larga escala • não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz) • fácil distribuição e transporte • desvantagens • muitas espécies não sobrevivem ao processo • viabilidade ocasionalmente insatisfatória • mão-de-obra especializada • requer equipamentos sofisticado

23. Congelamento em ultrafreezer • princípio • indução da dormência do microrganismo • armazenamento a - 80˚C • fatores a serem considerados • tipo de microrganismo • idade da cultura • concentração celular • agente crioprotetor (dimetilsufoxido 10%; glicerol 10% ou concentração maior) • condições de estocagem • método de descongelamento

24. Fungos filamentosos não esporulados Fungos filamentosos esporulados 1 mL 10 mL 1 mL 1 mL Bactérias, arqueas e leveduras 7 mL Congelamento

25. Congelamento em ultrafreezer

26. Congelamento em nitrogênio líquido • princípio • indução da dormência do microrganismo • armazenamento a - 196˚C • fatores a serem considerados • tipo de microrganismo • idade da cultura • concentração celular • agente crioprotetor • condições de estocagem • método de descongelamento

27. Congelamento em nitrogênio líquido

28. Congelamento em nitrogênio líquido • vantagens • condições estáveis por longos períodos • vedação completa, evitando contaminação • utilização para esporulados e não esporulados • desvantagens • viabilidade ocasionalmente insatisfatória • requer equipamento sofisticado • suprimento contínuo de N2 • boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento

29. Controle de qualidade de preservação • contagem de população viável antes e após preservação • determinar a taxa de mortalidade do microrganismo específico no protocolo utilizado • aplicável a métodos de médio e longo-termo • imprescindível para garantia de preservação de longo-termo • pureza • logo após o processamento do lote • viabilidade • primeira pós: até um mês após o processamento • segunda pós em diante: anualmente

30. (10-2) 9,9 mL água + 0,1% ágar (10-4) (10-6) (10-8) 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 10-2 10-4 10-8 10-6 Controle de qualidade de preservação Suspensão de células em crioprotetor no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x (fator de diluição) UFC/mL