Ana Gabriela Del Hierro Calvachi

1. ESTUDIO MORFOLÓGICO DEL IMPACTO DE PESTICIDAS CONVENCIONALES, BIOLÓGICOS Y ECOLÓGICOS, EN EL GRANO DE POLEN DE TOMATE DE ÁRBOL “Solanumbetaceum” Ana Gabriela Del Hierro Calvachi Agosto, 2013

2. Observar en el Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) cortes ultrafinos de polen que evidencien el efecto que causan los pesticidas convencionales, biológicos y ecológicos en la morfología del grano de polen tomate de árbol Solanum betaceum. Objetivo General

3. Objetivos Específicos • Establecer protocolos de: preparación de muestras, elaboración de resina Epoxy,infiltración y tinción de cortes ultrafinos. • Embeber las muestras de polen de tomate de árbol Solanum betaceum y realizar el tallado requerido para la obtención de secciones. • Realizar cortes finos mediante el ultramicrótomo Power Tome XL y observarlos en el microscopio óptico. • Observar las secciones ultrafinas del polen de Solanum betaceum en el TEM. • Definir el tipo de pesticida que genera daño en el desarrollo del tubo polínico mediante la observación en el TEM.

4. Justificación del problema [1]

6. Plagas comunes en tomate de árbol estimulan la germinación de conidias y el desarrollo de apresorios de algunos hongos afectan al desarrollo del fruto: presencia de ácaros,áfidos y moscas Ocasionan el 20% de las pérdidas de la agricultura Reducen la durabilidad de los árboles en el campo y la eficiencia de fertilizantes Hojas, ramas y frutos Hojas, raíz, frutos Hojas y frutos Raíz [3]

7. Enfermedades foliares Lancha o tizón- AlternariaspCercosporaspColletotrichumglocosporioides Oidio o ceniza -Oidium sp lancha tardía -phytophthora infestans

8. Enfermedades en el fruto Antracnosis del fruto Colletotrichumglocosporioides [2] C. acutacum

9. Formación del grano de polen • desarrollo

10. PALINOLOGÍA Estudio del polen, las esporas y los materiales biológicos que las componen a partir de los cuales se ha reconocido el origen y las características de las plantas POLEN es el vehículo natural para la transferencia de caracteres genéticos de la planta al contener a los gametos masculinos [7]

11. METODOLOGÍA

12. Preparación de muestras TEM 7 horas 1 hora 1 hora y toda la noche 1 día y una noche 30 min 36 horas 72 horas

13. Extracción de la muestra

14. Germinación

15. Fijación GLUTARALDEHÍDO 2% + BUFFER FOSFATO Actúa como factor de combinación en los componentes internos de la célula Los grupos carbonilos de los aldehídos reaccionan con grupo R de los Aa [16]

16. Posfijación TETRAÓXIDO DE OSMIO 1% por 1 hora Reacciona con los dobles enlaces de los lípidos insaturados de la membrana lipídica • Ventajas del procedimiento: • Da contraste a la muestra y permite reducir la pérdida de muestra • Solución: • Centrifugación 5000 rpm 30 s [11]

17. Deshidratación Soluciones de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 99.9% • Problemas del procedimiento: • Pérdida de muestra • Solución: • Centrifugación 5000 rpm 30 s [12]

18. Infiltración Acetonitrilo + resina EPOXY Compuesta por dos monómero específicos un endurecedor un acelerador Menos tóxico No es carcinogénico Solvente bipolar altamente miscible en agua, alcoholes, ésteres y en resina epoxy Epon 812 anhídrido dodecinil succínico(DDSA) anhídrido metilnádico (MNA) 2,4,6 tris (dimetilaminometil) fenol (BDMA) [15]

19. Seccionamiento Tallado Cuchillas Espesor Formación de una pirámide truncada que contenga la muestra en el centro Deben presentar filos agudos que no dañen las secciones Semifinos: 0.5 a 0.2 μm Finos: 50 a 100 nm Ultrafinos: 30 a 60 nm Sólo puede verificarse de acuerdo a la coloración [14]

20. Tinción doble Acetato de uranilo 1% y Citrato de plomo 2% Se une a compuestos aniónicos como grupos fosfato asociados con ácidos nucléicos y fosfolípidos Reacciona con grupos carboxilos como Aa, proteínas Dispersa electrones con efectividad e interactúa en los mismos lugares del acetato de uranilo para mejorar la tinción [13]

21. Dificultad del procedimiento: • Recoger las secciones • Pérdida de secciones • Solución: • Calentamiento de Mesh después del recubrimiento con oro

22. Observación M. ÓPTICO POLEN DE TOMATE DE ÁRBOL M. DE BARRIDO M. DE TRANSMISIÓN M. DE BARRIDO

23. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

24. Errores de cuchilla Problemas en la infiltración

25. Formación de precipitados Cortes en diferentes lugares del polen

26. Controles sin germinación Controles con germinación

27. Pesticidas biológicos A, B

28. A

29. B

30. Pesticidas Ecológicos C, D

31. C

32. D

33. Pesticidas Químicos E, F

34. E

35. F

36. Análisis Estadístico

37. Odd Ratio Hipótesis nula (Ho): La exposición a pesticidas convencionales, biológicos y ecológicos incide signicativamente sobre la morfología del polen.. OR>1 indica que hay una asociación que es más fuerte como mayor sea el número. Factor de Riesgo

38. Conclusiones De los tres tipos de pesticidas empleados los productos de tipo químico generan un daño del 80% de los pólenes observados. Seguido por los pesticida ecológicos que dañan el 50% de los pólenes y por último los pesticidas biológicos que generan una variación en la morfología del 10 %. Los pesticidas de tipo químico son los productos que ocasionan mayores cambios en la morfología del polen, la intina y los núcleos internos presentes. El estudio de la morfología del polen ante los efectos de pesticidas ayudó a evaluar la variabilidad real del polen, la cual se refleja en una afectación significativa en la fertilidad del polen que debería ser tomado en la agricultura ya que el desarrollo del polen está ligado con la reproducción sexual de la planta

39. Recomendaciones Los resultados obtenidos evidenciaron que existe una variación en la morfología del polen por lo que sería interesante ampliar el estudio a nivel molecular para dar a conocer las mutaciones ocasionadas por los pesticidas en el polen. Para complementar la información obtenida acerca del efecto de los pesticidas sobre el grano de polen se podría también realizar un estudio bioquímico de rutas biológicas afectadas por el uso de pesticidas que expliquen la variación en la morfología interna del polen.

40. GRACIAS

41. Bibliografía • [1] M Ríos. Control biológico de la antracnosis (colletotrichum gloesporioides penz) en tomate de árbol (solanum betaceum) en el ecotipo: amarillo puntón, mediante hongos endótos antagonistas. Ingeniería Agropecuaria Industrial CUE - Tesis de Pregrado, page 150, 2010. • [2] D Lucio, S Espín, and N Soria. Niveles residuales de plaguicidas en frutas andina: Tomate de árbol (cyphomandra betacea s) y naranajilla (solanum quitoense) INIAP, 1997. • [3] Calvo;I. Cultivo de tomate de arbol (cyphomandra betaceae)area: Manejo integrado de cultivos / frutales de altura. costa rica. 2012. Proyecto Microcuenca Plantón -Pacayas Boletín técnico No. 8, Costa Rica, Noviembre 2009. • [4] Tort. Eects of some fungicides on pollen morphology and anatomy of tomato(lycopersico esculentum mill.). PakistanJournal of Botany, I:23 30, 2005. • [5] W Punt, P Hoen, S Blackmore, S Nilsson, and A Le Thomas. Glossary of pollenand spore terminology. Paleobotany & Palynology, page 81, 2007. • [6] Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. Residuos de plaguicidas en los alimentos, 1981: informe de la reunión conjunta del cuadro de expertos de la FAO en residuos de plaguicidas en los alimentos y en el medio ambiente. FAO, 1982. • [7] R Hesse, H Halbritter, R Zetter, M Weber, R Buchner, A Frosch-Radivo, and S Ulrich. Pollen Terminology. SpringerWienNewYork, 2009. • [8] K Esau. Anatomía de las plantas con semilla. 1982.

42. [9] D Honys, D Reòák, and D Twell. Male gametophyte development and function. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology, I:76 87, 2006. • [10] A González. Botánica morfológica, morfología de plantas vasculares, 2008. • [11] J Bozzola and L Russell. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. Jones & Bartlett Learning, 1999 • [12] S Beck. Electron Microscopy:A Handbook of Techniques for the Biologist . Nassau. Community College, 2010 • [13] L Daddow. A double lead stain method for enhancing contrast of ultrathin sections in electron microscopy: a modied multiple staining technique. Journal of Microscopy, 129:147: 153, 1983. • [14] M Hayat. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. Cambridge University Press, 2000. • [15] D. Kuhlmann. . Microtomy of tissue specimens, collection of sections. Heidelberg. 2008. • [16] John Kuo. Electron Microscopy: Principles and Protocols. Humana Press, 2007.