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Principi e basi della diagnostica virologica

Principi e basi della diagnostica virologica. A.Azzi, Firenze 19.11.2004. L’importanza della diagnosi. Esclusione di altre cause Impiego di terapie antivirali Nella prevenzione. Diagnosi precoce. Diagnosi rapida. Diagnosi indiretta (sierologica) Sieroconversione Aumento del titolo

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Principi e basi della diagnostica virologica

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Presentation Transcript

  1. Principi e basi della diagnostica virologica A.Azzi, Firenze 19.11.2004

  2. L’importanza della diagnosi • Esclusione di altre cause • Impiego di terapie antivirali • Nella prevenzione Diagnosi precoce Diagnosirapida

  3. Diagnosi indiretta (sierologica) Sieroconversione Aumento del titolo Presenza di IgM specifiche Avidità delle IgG Diagnosi diretta Ricerca del virus (o di sue componenti) Approcci diagnostici Manifestazioni cliniche Il rischio infettivo in ambito trasfusionale

  4. Diagnosi sierologica • Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (03/03/03) del Sig ZZ: positivo Il sig ZZ ha una infezione da HIV

  5. Diagnosi sierologica Il sig XY gode di ottima salute !!! • Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo • Risultato ricerca di anticorpi anti-HBsAg nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo • Risultato ricerca di anticorpi anti HCV nel cs (04/04/04) del Sig XY: IgM neg, IgG pos

  6. Diagnosi indiretta: limiti • Malattie causate da: • riattivazione di virus latenti o infezioni persistenti In: • pazienti immunodepressi • Disponibilità dei campioni

  7. La ricerca del virus

  8. La ricerca del virus • L’isolamento • Nell’aminale • Nelle uova embrionate • Nelle colture cellulari

  9. Isolamento nelle colture cellulari • Effetti dello sviluppo del virus • ECP (+/- specifico) • Emoadsorbimento • ………………… Necessità di test identificazione del virus: neutralizzazione, IEA, IF …………..

  10. Effetti citopatici da virus Morte cellulare • Arrotondamento • Degenerazione • Aggregazione • Perdita di adesione al substrato Cambiamenti istologici caratteristici: inclusioni nucleari o citoplasmatiche Formazione di sincizi Cambiamenti della superficie cellulare: espressione di antigeni virali emoadsorbimento

  11. Problemi nell’impiego delle colture cellulari • Tempi lunghi per comparsa ECP • Determinanti le condizioni di conservazione del campione. • Possibii contaminazioni batteriche e fungine. • Sostanza tossiche presenti nel campione. • Molti virus non crescono nelle colture cellulari e.g. Hepatitis B, Diarrhoeal viruses, parvovirus, papillomavirus.

  12. Test rapidi • Ricerca di Ag dei virus influenzali A e B • Test immunoenzimatico (ELISA) • Supporto: membrana di nitrocellulosa • Ab monoclonali specifici per la NP virale • Campioni: lavaggi e aspirati nasofaringei, TF • Tempo: 15 minuti • Distinzione dei tipi (A-B)

  13. Antigeni virali Nel siero: antigeni solubili Nelle cellule : antigeni di superficie o intracellulari Acido nucleico virale Tecniche di amplificazione …. ma non solo La ricerca di componenti del virus nel campione clinico HBsAg, HBeAg p24 Tecniche di immunoprecipitazione immunoenzimatiche • Tecniche quantitative • nel monitoraggio dell’infezione • e della terapia • Analisi delle sequenze per la determinazione delle resistenze, per la genotipizzazione, per l’epidemiologia Immunofluorescenza immunoistochimica

  14. EM/IEM Isolamento Ricerca antigeni Virus non coltivabili Scarsamente visualizzabili Agentisconosciuti Costi Manualità Tempi Manualità Sensibilità Difficoltà di individuare antigeni (HCV,TTV…) Limiti tecniche “tradizionali”

  15. Tecniche di ibridazione • Impiego prevalente per rivelazione e conferma specifictà prodotti di amplificazione • Ibridazione in situ • Nuove versioni

  16. Quali tecniche di amplificazione • Amplificazione della sequenza bersaglio • Amplificazione del segnale • Amplificazione della sonda Applicazioni qualitative e quantitative Non solo PCR

  17. Per quali esigenze: • per virus non coltivabili o • coltivabili con difficoltà • a lento sviluppo - effetto • per virus “ad alto rischio” • per la ricerca di virus nel liquor • o comunque • in campioni in cui la carica virale sia bassa Virus epatite B e C Papillomavirus Parvovirus B19, TTV

  18. Impiego delle tecniche di biologia molecolare nella diagnostica virologica Applicazioni quantitative per • distinzione tra infezione latente e infezione attiva (riattivazione) • monitoraggio infezione(prognosi) • monitoraggio terapia • valutazione del rischio di trasmissione

  19. Antigeni virali Acido nucleico virale La ricerca di componenti del virus nel campione clinico Sensibilità + Specificità +++ Rapidità ++++ Sensibilità +++ Specificità +++ Rapidità ++

  20. L’interpretazione • L’immunodepressione • Infezioni virali latenti e infezioni virali persistenti • Infezioni subcliniche Può rendere poco attendibili i risultati della sierologia L’uso di tecniche molto sensibili rende Necessario riconsiderare il valore diagnostico di un risultato positivo

  21. 1 2 3 4 HCV RNA EIA 3.0 EIA 2.0 EIA 1.0 HCV RNA EIA 3.0 EIA 2.0 EIA 1.0 0 13 70 80 150 0 13 70 80 150 (giorni) Infezione Infection I marcatori sierologici dell’HCV nel periodo seguente all’infezione Ortho-Clinical Diagnostics

  22. Nuovi sviluppi • L’analisi delle sequenze nella diagnostica virologica • Genotipizzazione • Nuove tecnologie • Amplificazione real time • Microarray • Pyrosequencing

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