Evidence for a functional RNA element in the hepatitis C virus core gene

1. Evidence for a functional RNA element in the hepatitis C virus core gene Laura K. McMullan, Arash Grakoui, Matthew J. Evans, Kathleen Mihalik, Montserrat Puig, Andrea D. Branch, Stephen M. Feinstone, and Charles M. Rice PNAS,February 2007

2. HCV • - Long CDS codant une polyprotéine clivée ensuite pour donner les protéines virales • - Présence d’une région hautement conservée ce qui est atypique vu la « fiabilité » de • la polymérase virale • - CDS alternative (ARF = Alternative Reading Frame) détectée dans cette région • - ARF code pour 2 protéines – F et DF • - Passage ORF → ARF par un de frame-shift • ARF • - Ac anti-ARF détectés chez des patients => ARF traduite • - Protéine(s) ARF non indispensables à la réplication virale (mutations non-sens) • - Apparition et sélection de révertants • Matériel et Méthodes • 1. In vivo • - Mutagénèse • - Infection de chimpanzés • - Analyses de sérum et hépatocytes • 2. In vitro • - Séquençage • - Cultures cellulaires (Huh 7 et Huh 7.5)

3. Mutagénèse • - Introduction de 4 codons STOP Site frame-shift 1 Site frame-shift 2

4. Evolution de la charge virale après infection de chimpanzés avec le virus muté • [HCV] et [ALT] moins élevées par rapport à des cinétiques obtenues avec des virus wt • Virus maîtrisé au bout de 10-14 semaines (atténuation probable due aux mutations) • Souche moins virulente mais réponse cellulaire forte

5. Séquençages hebdomadaires des virus circulants • Apparition et sélection de révertants dans les codons STOP 3 et 4 • Restauration de la séquence wt de la protéine DF

6. Effets des mutations dans l’ARF sur des hépatocytes en culture • Le virus muté se réplique moins bien • Les réversions dans les codons STOP 3 et 4 restaurent la réplication aux niveaux du wt • Ce sont les codons STOP 3 et 4 qui sont responsables de la baisse de la réplication

7. Etude du pouvoir infectieux et pathogène du virus chimérique H/JFH STOP 1,2,3,4 3’ NTR 5’ NTR NS2 NS3 JFH H77 virus chimérique H/JFH • Virus recombinant infectieux grâce à 2 mutations adaptatives

8. Réplication du virus H/JFH STOP 1,2,3,4 pol- H/JFH STOP 1,2,3,4 H/JFH Détection de NS5A (brown) et des noyauw cellulaires (bleu) au jour 7 21 41 • Réplication initialement faible du virus H/JFH STOP 1,2,3,4 • Réplication virale de plus en plus intense

9. Apparition progressive de révertants • Coexistence transitoire des révertants et des mutants • Disparition du mutant au bout de 3 semaines

10. Concluison • Un mutant non-sens au niveau de l’ARF est moins virulent mais capable de générer • une réponse immunitaire de type cellulaire normale qui finit par maîtriser rapidement • l’infection • Protéines prédites à partir de l’ARF non détectées • Les protéines potentiellement codées par l’ARF ne sont pas indispensables à la • réplication virale (absence possible de traduction) • Emergence de révertants • => pression de sélection • Les réversions restaurent les appariements au niveau des tiges de la structure 3D de • l’ARN viral • => la structure 3D de l’ARN correspondant à l’ARF • est importante pour le virus

11. Structure prédite de l’ARN transcrit à partir de l’ARF • Rôle soupçonné dans la régulation de la • réplication et de la transcription (interaction de l’ARF avec 5’NTR) • Participation possible de l’ARN ARF dans des • complexes d’ARN régulateurs plus grands