1 / 36

Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus

Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus. TEM és FM, símaizomsejt thrombospondin tartalom ER-ben. Bombix mori csáp km. a: konvencionális b: kriofixálás c: freeze-substitution. STEM – EELS anyagszerkezeti alkalmazás.

melvin-schmidt
Download Presentation

Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus TEM és FM, símaizomsejt thrombospondin tartalom ER-ben Bombix mori csáp km. a: konvencionális b: kriofixálás c: freeze-substitution

  2. STEM – EELS anyagszerkezeti alkalmazás

  3. Növényi elektronmikroszkópos technikák 1. Áttekintés 1.1. Az EM munka célja 1.2. Feltételei 1.3. Lehetőségei 1.4. Korlátai 1.4.1 Felbontás - mélységélesség 1.4.2 Felhasználhatóság - alkalmazhatóság 1.4.3 Hibái – műtermékek 1.4.4 Költség, idő 1.5 Az EM, mint módszer értékelése

  4. 2. Konvencionális minta-előkészítés TEM-re 2.1 Főbb lépések: mintavétel ----------------FM fixálás víztelenítés átitatás beágyazás – minta blokkban kés grid ultramikrotóm (hártya) metszés------------ FM festés TEM VIZSGÁLAT EREDMÉNY „processing”

  5. 1947, in vitro tenyésztett sejt széli régiója patkány mirigyes szövet A:1956 B:1962 – minőségi változás jelentős

  6. 2.2 Történetiség 2.2.1 Műszaki fejlődés 2.2.2 Tudományos fejlődés 3. Mintavétel 3.1 A minta kiválasztása 3.2 Mintaszám 3.3 Minták kezelése 3.3.1 Manuális munka 3.3.2 Dokumentálás – fixálási napló 4. Fixálás: life-like state /változás minimalizálása/ Fixálás jó: minta olyan, mint FM-ben /félvékony metszeten/ ha strukturális sérülés nincs ha térfogatváltozás nincs ha különböző fixálókkal is u.a. az eredmény

  7. Fixáló: + stabilizálja az „élő” struktúrát - attól (jelentősen) eltérő struktúrát eredményez rossz fixálás: fiziológiás elváltozás strukturális elváltozás apróbb (strukturális, térfogati) változás jó fixálás: nincs látható elváltozás 4.1 Fixáló oldat: a. fixáló ágens b. hordozó közeg Fixálási környezet: pH ozmolaritás ion koncentráció és összetétel

  8. 4.1.1. Fixálók: teroxidok /OsO4, RuO4, ruthenium hexammine trichloride/ aldehidek /GA, FA, akrolein, stb./ KMnO4 /és más permanganátok/ uranil acetát 4.1.2 „Hordozó” közeg: követelmények: állandó pH fixálás során ozmolaritás ionösszetétel ne legyen toxikus, büdös pufferek + ozmotikumok + ionok foszfát puffer /Sörensen f./ jó kakodilát puffer As (toxikus) veronál acetát puffer barbiturál (toxikus) és büdös kollidin büdös (piridin) szerves pufferek jók, de drágábbak

  9. 4.1.2.1 pH: 6.8 – 7.5 (8) OsO4 – pH: 6.0 uranil acetát – pH: 5.0 4.1.2.2 Ozmolaritás: minta saját ozmolaritása (optimális) fixáló penetrációja membrán permeábilitás változás fixáláskor fixáló ozmotikumként viselkedik-e kissé hipertóniás jobb, mint hipotóniás beállítás:puffer koncentráció (itt nem a fixálóé!) fixáló koncentráció ozmotikum (NaCl,glukóz, szacharóz, mannitol) gl., szach. OsO4-nál nem, aldehideknél jó 4.1.2.3 Ionösszetétel: monovalens jó (NaCl) bivalensmembránokra jó, De: precipitáció, fiziológiás elváltozás (Ca, Mg, bikarbonát) lehet!

  10. Amőba sejt részlete A: konvencionális, enyhén hiperozmotikus környezet B: freeze-substitution Apró különbségek: plazmamembrán és vakuolumok membránjainak „kifeszült” megjelenése

  11. 4.2 Pufferek: 4.2.1 Foszfát puffer:+ fiziológiás bivalens ionok nem toxikus pH nem változik a hőmérséklettel, stabil - precipitáció lehet mikroorganizmusok szeretik lassú penetrációjú és reaktív fixálókhoz is Sörensen féle mono- és dibázikus Na-foszfát Na-K-foszfát 4.2.2 Kakodilát puffer: + stabil nincs csapadék - rossz szagú toxikus aldehidekkel (első fix.) foszfát pufferhez hasonló eredmény

  12. 4.2.3 Veronál acetát puffer: + nincs csapadék /2. és 3. fix./ - csak néhány szövetre jó (OsO4-el) nem tárolható (mikroorganizmusok) aldehidekkel reagál (puffer kapac.) 4.2.4 Kollidin: -(s)-kollidin (2.4.6-trimetil piridin) Nem ajánlható, csak speciális esetben!! + pH:7.4-nél igen jó puffer kapacitás szobahőn is stabil jól penetrál – nagy blokkok fixálása - extrakció - OsO4 /nagy blokk és 2. fix. -jobb/ membránsérülések toxikus és büdös

  13. 4.2.5 PIPES puffer: piperazin-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) 0.3 M ozmolaritást ellenőrizni /2x-3x hígítani/ pH 6.1-7.5 között 0.1 M NaOH  4.2.6 HEPES puffer: N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid 0.2 M pH 6.8-8.2 között -0.2 M NaOH 4.2.7 MOPS puffer: 3-(N-morpholino)propane-sulfonic acid 0.2 M pH 6.5-7.9 között-0.2 M NaOH

  14. Neutrofil granulocita A FA+foszfát puffer – jó struktura B FA+kakodilát puffer – jó struktura C FA+kollidin – erős kimosódás, membránsérülések

  15. 4.3 Fixálók: 4.3.1 Tetroxidok 4.3.1.1 OsO4 : 1927 Strangeway and Canti – FM fixálók sötétlátóteres mikroszkópia- „jobb felbontás” 1940-1950 EM – első ultravékony metszetek lassú penetrálás – kicsi minta /0.5-1 mm átmérő/ /puffer meggyorsíthatja – ion és membrán kölcsönhatás/ főként lipideket (foszfolipid) fixál /ezeket aldehidek nem!/ festés is egyben membrán permeábilis lesz – minta ozmolaritása változik /puffer kevésbé fontos 2. fix.-nál/

  16. Os4 fixálásra elváltozás:mielin – zsugorodás izolált sejtek – enyhe duzzadás (NaCl) Ca – jó /1-3 mM , ha több: precipitáció) Mg – jobb?? csersav hozzáadása: jobb fixálás, jobb nehézfém ion kötés Forgalmazás: kristályos ill. oldott - ampulla Tárolás Előkészítés: törzsoldat oldás – 24 óra!!! szonikálás – rövidebb idő használat: elszívófülke!!! /erősen párolog/ hulladék kezelése műanyagon át is penetrál

  17. használat: elszívófülke!!! /erősen párolog, nyálkahártya irritáló/ erős oxidálószer – mindent feketére színez hulladék kezelése műanyagon át is penetrál alkalmazhatóság: foszfát puffer + OsO4– jó (de csersavval nem) kakodilát puffer + OsO4– inkább 2. fix., (csersavval is) veronál a. puffer + OsO4– nem ajánlott (2. fixálás) kollidin + OsO4–nem ajánlott (2. fixálás) ma: GA után, mint 2. fixáló

  18. 4.3.1.2    Ruténium tetroxid (RuO4) fixálás-festés 1887-től napjainkban részben hisztokémia, részben fixáló fixáláskor történő alkalmazása ritka + poliszacharidokkal is reagál finomszemcsés festődés – jobb feloldás - nehezen penetrál, külső sejteket fixálja csak gomba sejtfalon (intakt) is nehezen jut át protoplasztok, izolált sejtek, kis minták (1 mm3 ) jó szobahőmérsékleten fixálás (4 oC nem ajánlott) erőteljes oxidálószer, bomlékony (friss: aranysárga) egészségre káros - elszívófülke

  19. forgalmazás: kristályos 0.5 % oldat – ampullában fixálás (egyben festés): 0.03-0.05% RuO4 oldat

  20. 4.3.1.2  RHT – Ruthenium hexammine trichloride Mw: 309.6 inkább festék, de OsO4 után alkalmazzák nagy töltéssűrűség (3+), kis molekulasúly, nincs aggregáció OsO4 után RHT (kakodilát puffer) – nem kell utólagos festés finomszemcsés festődés – jobb feloldás GA-val stabilizáló – proteoglikánok, szénhidrátok, (kakodilát p.) extracelluláris mátrix + 2.5 % GA+ 1% OsO40.1-0.7 % RHT pH: 7.4 fixálás: szoba hőmérsékleten (4 oC nem ajánlott) oldatot használat előtt 1 órával csinálni!!! /bomlás/ foszfát puffer és kollidin nem optimális hozzá forgalmazás: aranysárga por, stabil forma éveken át

  21. O 4.3.2 Aldehidek:– C H OO glutáraldehidC – CH2 – CH2 – CH2 – C HH O formaldehidH – C H OO paraformaldehidC – O– CH2 (– O CH2 )n– O – C H H CH2 akrolein CH O C H (glioxál, krotonaldehid, acetaldehid, metakrolein) foszfát és kakodilát pufferben jó fixálók (esetleg kollidin)

  22. 4.3.2.1 Glutáraldehid (GA): önállóan nem jó igazán • /OsO4 sem!/ • napjainkban: GA + OsO4 illetve (FA+GA) + OsO4 • + dialdehid – keresztkötés – tárolható minta • fehérjékkel reagál – OsO4 mellett fehérje extrakció kisebb • /glikogénnel reagál – OsO4 erősebben festi/ • lipidekkel nem reagál /akár 95% veszteség, OsO4ezt csökkenti/ • nem változtatja meg az ozmotikus viszonyokat a mintában • belépéskor, így a puffer ozmolaritása meghatározó • Tehát GA jó fixáló, de OsO4 utófixálás elengedhetetlen

  23. GA minősége: monomer – polimer aránytól függ /280 nm/ /235/ nm tisztítás: desztillálás 100-101 oC (olaj 154 oC) aktívszenes mosás – szűrés tárolás: hőmérséklet igen fontos (+4, vagy -20 oC) forgalmazás: ampullázott (25, 50%) „nyers” oldat (elvileg 25%) pH: 6.8 – 7.5 (7.5 felett GA polimerizálódik) használat: 2-4% első fixálóként (0.05% előfixálásnál) Ca használata nem zavaró pufferek: foszfát puffer – jó kakodilát puffer – jó veronál acetát puffer – nem használható kollidin – nem ajánlott szerves pufferek – jók

  24. 4.3.2.2 Formaldehid (FA): eleinte rossz volt (11-16% metanol!) paraformaldehidből frissen – jó fixáló +jól penetrál (nagyobb blokkok, precipitáció kisebb) foszfát puffer kissé lemarad fehérjékkel reagál – de monoaldehid! lipidekkel is reagál (korlátozottan) -fixálás után a minta pufferben nem tartható el hosszan lipidekre utófixálás kell FA nemozmotikum – puffer ozmolaritása meghatározó (membrán szemipermeabilitás részben megmarad) FA jó fixáló, jól penetrál, de OsO4 utófixálás kell, Ca jó

  25. FA felhasználás: foszfát puffer – jó, ha lehet, ezt használni – 4% FA kakodilát puffer – jó, Ca kell, hűtőben stabil – 4% FA veronál acetát puffer – kerülni kollidin – 10% FA nagy blokk, jobb behatolás, deextraktív, ezért csak indokolt esetben GA + FA keverék jobb hatásfokú első fixáláshoz FA gyors penetráció, reaktívabb GA keresztkötések, stabilizál 4% FA + 2% GA + 0.03% CaCl2 0.07–0.1 M kakodilát /foszfát/ puffer

  26. 4.3.2.3 Akrolein:nagy/tömött/növényi minták +leggyorsabban penetráló aldehid fixáló /0.5-1%/ - toxikus lipidoldó hatás enzimaktivitást gátló mikrotubulusok szétesnek Akrolein+GA – FA+GA alternatív /OsO4 utófixálás kell/ 1% akrolein + 2-4% GA (0.1 M foszfát puffer, pH7.2) ozmolaritás, CaCl2 vagy MgCl2 1-3 mM Akrolein+GA+FA igen tömör, növényi anyagokhoz

  27. 4.3.3 Permanganátok: KMnO4 /Na-, Zn-, Ba-, La-permanganát/ régebben gyakori volt , ma botanikai, mikológiai, membránvizsgálatoknál kivételesen - extraktív hatás (GA+ OsO4 fixálás hasonlítás) fehérje, lipid (membránt is károsítja) RNA (DNA megőrződik, bár rosszul) duzzadás, morfológiai deformáció – 0.5% NaCl 0.5-1% KMnO4 /K2Cr2O7+ OsO4 jobb, de nem jelentősen/

  28. 4.3.4 Keverék fixálók:pl. GA+ OsO4együtt más hatás, mint egymás után– reagálnak más állapotúak (?) kompetició az aminosavakért (?) frissen készíteni 2.5% GA+1% OsO4 0.1M kakodilát pufferben (pH:7.2), utófixálás uranil acetátban 0 oC max. 1 óra 4.3.5 Speciális fixálók: inkább csak adalékként szerepelnek uranil acetát: membrán stabilizáló (?) enyhe extrakció /pl.glikogénre/ 0.25-2% víz, veronál acetát puffer pH:5.0 !! /foszfát és kakodilát nem, kiválások!/ ferricianid, digitonin, trinitro-komponensek (pikrinsav származékok)

  29. 4.4 Fixálás módja: általános recept nincs! irodalmi receptek hasonlót adaptálni - módosítani általános szempontok: gyorsan (degradáció megelőzése) immerziós in situ perfúziós kicsi minta (penetráció), ha nagy minta – nagy penetrációjú fixáló és puffer (FA, akrolein, kollidin) keverés kicsi edények (anyag, pénz) idő /mintafüggő/ - hosszú: műtermék képződés hőmérséklet /pl. mikrotubulusok alacsony hőn rosszul/ mikrohullámú sugárzás diffúzió /hő!/ rotáció reakció ráta

  30. mosás: aldehid – OsO4 között fontos 0.5-2 óra /éjszaka/ - tárolás mosás a „hordozóval” /bár ozmolaritás itt már nem olyan fontos/ növényi minták: vízvesztést kerülni, kicsi minta, kettős fixálás, vákuum – szőrök közötti, intercelluláris térben levegő gombák: mint növények, celofán módszer monolayer kultúrák: petri csészében,tárgy-, vagy fedőlemezen (teflon spray) izolált sejtek, sejtorganellumok: centrifugálás, szűrés, agar,alginát, fehérje baktériumok: agar, alginát, fehérje tengeri élőlények: GA és OsO4 tengervízben oldva

  31. 5. Dehidratáció: (min. minta V 10x) etanol aceton hasonló hatás, de aceton erősebben higroszkópos, így dehidrálás tökéletlen lehet (abs. aceton lépésnél) gyanta minősége döntő: vízoldékony – nem kell polieszter – aceton etanol, végén aceton etanol, végén sztirén epoxi – aceton etanol, végén propilénoxid

  32. 5.1 Kémiai hatás dehidratálás: minta – oldószer 5.1.1 Lipid kioldás:akár 95% (főleg 70% felett, ill. PO) mértéke redukálható OsO4 fixálás uranil acetát fixálás aceton használata alacsony hőmérséklet gyors munka 5.1.2 Fehérje kioldás: kb. 4% (főleg (70% alatt, 95% - PO nincs) mértéke redukálható GA fixálás gyors munka 5.1.3 Lipid és fehérje kioldás miatt zsugorodás – minimalizálni dehidratáció gyenge hatású artefakt képző, fixálókhoz hasonló nem kritikus lépése a munkának Lehet 0 oC-on, 4 oC-on, szobahőn – nincs igazán nagy jelentősége

  33. 5.2 Általános menete: (15), 25, 50, 70, 90, 96(95), 100% etanol, v. aceton intermedier folyadék (pl. etanol után PO) – párolgás, tűzveszélyes 10-15 perc az egyes lépésekre (kompakt anyag, növényi minta, nagy blokk 20 perc) idő csökkenthető: minták mozgatása, közeg keverése szobahőmérsékleten 4 vagy 0 oC helyett oldatok cseréje kisebb blokkok (infiltráció is gyorsabb!)   tárolás – éjszakára 70% etanolban (hűtőszekrényben) szupergyors víztelenítés: a fentieket maximálisan kihasználva így kb. 2 percre is csökkenhet a dehidratáció + 1 perc absz. etanol + 2 perc PO (3x csere!)

  34. 5.3 Részleges dehidratálás: pl. EPON 812 oldható 70% etanolban menete: 30% (15’), 70% (30’), 70% (30’) 1:1 70% etanol és EPON 812 keverék (30’) beágyazó EPON 812 szobahőmérsékleten (60’) beágyazó EPON 812 37 oC (30’) polimerizáció

  35. 5.4 Etilén glikol:fixálás nélküli víztelenítés nem okoz jelentős konformáció változást (immunológiai, citokémiai alkalmazás) PEG 200 is használható menete: 5 ml 10% etilén glikol 50% fölé növelni 5 perc alatt (cseppenként 7 ml etilén glikol hozzáadás, rázatás, szövet átlátszó lesz) további víztelenítés (2-3 perc tiszta e.g.-ban) a minta 4 oC-on eltartható tiszta etilén glikolban, abból közvetlenül átvihető:hidroxipropil metakrilátba epoxi gyantába poliészter gyantába nem! lipid vesztés van! (70% e.g.-ban GA és OsO4 véd) zsugorodás és destrukció van

  36. 5.5 Intermedier folyadék: etanol, propilén oxid szerepe: intermedier dehidratáló infiltráció közege I.             infiltráció:cc. PO + gyanta (1:1) (fokozatosabb átmenet 2:1, 1:1, 2:1) II.               infiltráció dehidratálás közben: 20 és 40% PO vízben 70% vizes PO + EPON 812 (1:1) 90% vizes PO + EPON 812 (1:1) 100% PO + EPON 812 (1:1) tiszta EPON 812

More Related