Fundação Universidade Federal do Rio Grande Instituto de Oceanografia

1. Fundação Universidade Federal do Rio Grande Instituto de Oceanografia Disciplina de Poluição Marinha CROMATOGRAFIA (aula 1) Ítalo Braga de Castro

2. Definição: É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura por interação entre uma fase estacionária e uma fase móvel. Fase Estacionária: sólido (ou líquido impregnado com sólido) que permanece dentro da coluna de separação. Fase Móvel: solvente (gás ou líquido) que se move através da coluna, carregando os solutos.

3. éter de petróleo mistura de pigmentos CaCO3 pigmentos separados Histórico: M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego)

4. Princípio:

5. Classificação: • 1-De acordo com o sistema cromatográfico • Em Coluna • Cromatografia Líquida • Cromatografia Gasosa • Cromatografia Supercrítica • Planar • Cromatografia em Camada Delgada (CDC) • Cromatografia em Papel (CP)

6. Classificação: • 2-De acordo com a Fase Móvel • Utilização de Gás • Cromatografia Gasosa (CG) • Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) • Utilização de Líquido • Cromatografia Líquida Clássica (CLC) • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) • Utilização de Gás Pressurizado • Cromatografia Supercrítica (CSC)

7. Classificação: • 3-De acordo com a Fase Estacionária • Líquida • Sólida • Quimicamente Ligadas • 4-De acordo com o Modo de Separação • Por adsorção • Por partição • Por troca iônica

8. Mecanismos de separação: Processos físicos -> Sorção “atrações polares”

10. Planar Gás L F L L F L S CGL CGFL CGS CB CLFL CTI L CSS Classificação: CROMATOGRAFIA Em coluna Fluído supercrítico Líquido F L F L L L S S CP CCD CLL CSFL CLS CCD CE Técnica Fase Móvel Fase Estacionária Tipos de Cromatografia

11. Cromatografia em Papel: - Cromatografia Planar Líquido-líquido - Princípio: partição – relaciona a diferença de solubilidades dos componentes de uma mistura, na fase móvel e fase estacionária; - Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular • Análise qualitativa: Rf (fator de retenção); Rf = distância percorrida pela substância distância percorrida pela fase móvel

12. Cromatografia em camada delgada: • Método rápido (20-40 min.) • Uso de diversos agentes cromogênicos • Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g) • Grande gama de compostos pode ser analisada • Método simples e barato • F.M. - sistema de solventes • F.E - Adsorventes (sílica, alumina, celite, amido) • Métodos de detecção: físico-químicos • Princípio: Adsorção (polaridade)

13. Cromatografia em coluna: Pode ser também chamada de cromatografia líquida clássica. FE – sílica e alumina; FM – eluente; PRINCÍPIO: adsorção

14. FASE MÓVEL Fase estacionária injeção separação eluição DETECTOR Cromatografia Gasosa:

15. Cromatografia Gasosa: Cromatografia Gás-Sólido (CGS) Sólida FE sólida com uma grande área superficial e a separação baseia-se em mecanismos de adsorção das substâncias neste sólido. Em CG a FE pode ser: Cromatografia Gás-Líquido (CGL) Líquida FE líquida pouco volátil recobrindo um suporte sólido ou as paredes da coluna capilar. A separação baseia-se em mecanismo de partição das substâncias entre a fase líquida e gasosa.

16. Cromatografia Gasosa: • Rapidez • Alto poder de separação • Separação de várias classes de compostos em uma análise • Sensibilidade (ppm - ppb) • Facilidade de registrar dados • Variedade de detetores(especificidade) • Amostras voláteis • Compostos termicamente estáveis • Técnicas auxiliares p/ identificação

17. Cromatografia Gasosa (Aplicações): Quais misturas podem ser separadas por CG ? (para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve se dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gás) Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (“evaporáveis”) DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.

18. Cromatografia Gasosa (Aplicações): • Ambiental • Pesticidas, organoclorados e PCB’s • Hidrocarbonetos • Aminas e fenóis • Alimentos • Análise de ácidos graxos e triglicerídeos • Análise de compostos voláteis responsáveis pelo aroma característico de alimentos • Análise de açúcares e aminoácidos • Farmacêutica • Química Forense/Toxicologia • Doping • Metabólitos de drogas • Química Industrial • Petroquímica

19. Cromatógrafo de Fase Gasosa:

20. Cromatografia Gasosa: 1 6 2 5 4 1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento de Sinal. 6 - Registro 3

21. oxida / hidroliza algumas FE incompatíveis com DCE H2O, O2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC Gás de Arraste: Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE Requisitos: INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

22. A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) C CUSTO B A PUREZA Gás de Arraste: Requisitos: CUSTOGases de altíssima pureza podem ser muito caros. COMPATÍVEL COM DETECTORCada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.

23. Componentes necessários à linha de gás: controladores de vazão / pressão de gás dispositivos para purificação de gás (“traps”) 3 6 4 2 1 5 Gás de Arraste: 1 - Cilindro de Gás 2 - Regulador de Pressão Primário 3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás 4 - Regulador de Pressão Secundário 5 - Regulador de Vazão 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro) Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre

24. 1 2 3 4 Injetor: 1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica

25. Injeção:

26. Amostras Líquidas Amostras Gasosas COLUNA empacotada  = 3,2 mm (1/4”) 0,2 L ... 20 L 0,1 ml ... 50 mL capilar  = 0,25 mm 0,01 L ... 3 L 0,001 ml ... 0,1 mL Injeção: TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize imediatamente, mas sem ocasionar a sua decomposição. Regra Geral:Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

27. Microseringa de 10  L: agulha (inox 316) êmbolo corpo (pirex) Microseringa:

28. Colunas: EMPACOTADA  = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pul-verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR  = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recober-tas com um filme fino (fra-ção de m) de FE líquida ou sólida

29. Estrutura química do analito p0 = f Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração Colunas (parâmetros): Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0). ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)

30. Colunas (parâmetros): TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG

31. Detectores: Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.

32. Detectores: UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas

33. ~ 60 detectores já usados em CG ~ 15 equipam cromatógrafos comerciais 4 respondem pela maior parte das aplicações DCTTCD Detector por Condutividade Térmica DICFID Detector por Ionização em Chama DCEECD Detector por Captura de Eletrons EMMS Detector Es-pectrométrico de Massas

34. Detectores: DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD) • É um Detector de 2 canais • mede a diferença, em Condutividade Térmica , entre o Gás de Arraste (Referência) e o do Gás de Arraste + Amostra (analítico) • possui 2 pares de filamentos, 1 em cada canal , formando uma ponte. • As vazões dos 2 canais devem ser praticamente iguais • A presença de um componente, dissolvido no Gás de arraste, ao atingir o canal analítico muda a resistência deste filamento , provocando um desequilíbrio na ponteque gera um sinalproporcional a quantidade deste • A sua sensibilidade depende da corrente do Filamento , concentração dos componentes e da diferença da Condutividade Térmica entre o Gás de arraste e o componente .

35. TCD:

36. Detectores: DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID). • baseia-se no princípio de que a concentração de um composto é diretamente proporcional a concentração das partículas ionizadas presentes no mesmo • O Gás de arraste e os componentes que eluem da Coluna atingem a chama . Esta ioniza (queima) as moléculas orgânicas presentes na corrente gasosa . • As partículas ionizadas, entre os eletrodos, gera uma corrente que é medida através de uma resistência

37. FID: Collector Flame jet Air in Hydrogen in Column connection

38. Detectores: DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD) • É um Detector seletivo, específico para análises de Compostos Eletrofílicos (como os Halogênios nos Clorados) . • A cela do ECD é revestida internamente por uma lâmina do isótopo radioativo de “Ni-63”. • As “Partículas Beta” emitidas pelo isótopo ionizam o Carrier e os Íons e Elétrons resultantes migram para o anodo coletor por influencia de uma voltagem polarizada pulsante , aplicada entre a fonte e o coletor • A freqüência de pulsação é controlada para manter a corrente constante e é a geradora do sinal analítico . • É um Detector não destrutivo e altamente sensível, ideal para análise de pesticidas e agrotóxicos clorados

39. ECD: Collector 63Nickel foil Make-up gas in Column connection

40. Detectores: DETECTOR POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS • A GC/MS é uma técnica analítica , também bastante conhecida, que visa identificar positivamente e ou quantificar os componentes de uma mistura . • Os componentes da amostra, previam. separados no GC, são transferidas p/ o MS, através De uma linha de transferência. • No MS ocorre a fragmentação da molécula e a detecção, possibilitando ao usuário o detalhamento da estrutura e o peso molecular do composto. • Utilizando uma biblioteca específica podemos identificar positivamente o composto, baseado na abundância dos seus fragmentos (ions) .

42. Espectro de Massa (TBT):

43. Cromatografia Líquida: • CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA (CLC) • CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO (CLAE)

44. Preparo da coluna Aplica-se a amostra Eluente Detecção e quantificação (espectroscopia ou gravimetria) Cromatografia Líquida: Esquema para CLC:

45. Coluna fechada Injeção de amostra Detector Cromatogramas Cromatografia Líquida: Esquema para CLAE:

46. Cromatografia Líquida de Alta Resolução: • Características da Fase Móvel usada em CLAE: • Alto grau de pureza ou de fácil purificação; • Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes; • Não decompor ou dissolver a FE; • Ter baixa viscosidade; • Ser compatível ao detector utilizado; • Ter polaridade adequada para permitir uma separação dos componentes da amostra.

47. Cromatografia Líquida de Alta Resolução: • Tipos de amostras que podem ser analisadas por CLAE: • aminoácidos; • explosivos; • lipídeos polares; • metabólicos de animais e plantas; • pigmentos de plantas; • produtos farmacêuticos; • proteínas; • tintas.

48. FATOR CG CLAE Requisitos para amostra Amostra volátil ou derivatizável, termicamente estável na temperatura de operação do sistema cromatográfico. Amostra solúvel na fase móvel. Tipos de amostras Gases, líquidos ou sólidos MM: 2 a 1200 Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes. MM: 32 a 4.000.000 Quantidades mínimas detectáveis 10-12g 10-9 Tempo de análise Minutos até poucas horas Minutos até poucas horas Capacidade analítica Excelente, separação de amostras com até 200 componentes. Excelente, separação de amostras com até 50 componentes. Tempo de treinamento para um operador Cerca de 3 meses. Pelo menos 6 meses. Comparação entre CG e CLAE:

49. A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda: TEMPO Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade Separação deficiente de analitos com retenções próximas. Eficiência dos sistemas cromatográficos: Efeitos do alargamento excessivo de picos: EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

50. Identificação individual das espécies contidas na amostra Aplicações Qualitativas de CG RETENÇÃOUso de dados de retenção de um analito para sua identificação Determinação da identidade da amostra propriamente dita DETECÇÃODetectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas Fontes de Informações Qualitativas Análise Qualitativa: Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável combinação de dados provenientes de pelo menos duas fontes