Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 9 . Restrikční metody

1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 9. Restrikční metody Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2011

2. Restrikční metody - úvod Restrikční metody • využívají restrikční enzymy – endonukleázy (RE) • variabilita tvořena štěpením DNA - vznikající fragmenty vykazují délkový polymorfizmus = elektroforetický banding pattern • zejména před nástupem sekvenování DNA, nebo pro analýzu většího množství vzorků • RFLP, PCR-RFLP, T-RFLP – základem je Restriction Fragment Length Polymorphism

3. Restrikční metody - úvod Restrikční endonukleázy (RE) • skupina enzymů štěpící DNA - působí uvnitř dsDNA(× exonukleázy: štěpí DNA od konců, např. Exonuclease I – odstraňování PCR primerů před sekvenací) • rozeznávají specifický sekvenční motiv (4-8 párů bází), často tzv. palindrom: např. EcoRI: • délka motivu ovlivňuje pravděpodobnost výskytu daného restrikčního místa v genomu: 4-base cutters: 44 = restrikční místo v Ø na každých 256 bp 8-base cutters: 48 = restrikční místo v Ø na každých 65536 bp 5´- nnnnnnnnGAATTCnnnnnnnn - 3´ 3´- nnnnnnnnCTTAAGnnnnnnnn - 5´

4. Restrikční metody - úvod Restrikční endonukleázy (RE) • restrikčně-modifikační systém bakterií - obrana proti virům • názvy odvozené od bakterií, ze kterých byly vyizolované • isoschizomery: enzym izolovaný z jiné bakterie, ale rozeznává stejnou cílovou sekvenci např. XmnI: isoschizomery PdmI, Asp700I, MroxI

5. Restrikční metody - úvod Restrikční endonukleázy (RE) ▼ 5´- nnnnnnnnAG - 3´5´- CTnnnnnnnn - 3´ 3´- nnnnnnnnTC - 5´3´- GAnnnnnnnn - 5´ 5´- nnnnnnnnAGCTnnnnnnnn - 3´ 3´- nnnnnnnnTCGAnnnnnnnn - 5´ AluI + ▲ tupé konce (blunt ends) ▼ 5´- nnnnnnGATCnnnnnn - 3´ 3´- nnnnnnCTAGnnnnnn - 5´ 5´-nnnnnn - 3´ 5´- GATCnnnnnn - 3´ 3´-nnnnnnCTAG - 5´ 3´- nnnnnn - 5´ MboI + ▲ kohezivní konce (sticky ends): 5´ overhangs ▼ 5´- nGACCGAnnnnnnnnnnnnn - 3´ 3´- nCTGGCTnnnnnnnnnnnnn - 5´ 5´- nGACCGAnnnnnnnnnnn - 3´ 5´-nn - 3´ 3´-nCTGGCTnnnnnnnnn- 5´ 3´-nnnn- 5´ TaqII + ▲ kohezivní konce (sticky ends): 3´ overhangs štěpí mimo vlastní rozeznávanou sekvenci

6. Restrikční metody: PCR-RFLP PCR-RFLP (CAPS = Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) • detekce sekvenční variability pomocí restrikčních enzymů + využívá výhody PCR - stačí málo startovací genomové DNA • např. rozlišení sekvenčně odlišných druhů (nebo haplotypů) na základě výsledného banding patternu restrikce • PCR amplifikace konkrétního úseku DNA (případně lze pro zvýšení variability v multiplexu naamplifikovat více úseků najednou) • restrikce jedním nebo více enzymy generuje délkovou variabilitu fragmentů • jak vybrat vhodný restrikční enzym? • dříve naslepo zkoušeny dostupné RE, vybrány ty co generují variabilitu banding patternu • nebo nejdříve osekvenovat, a pak přímo vybrat RE cílený na dané variabilní místo (místa) → někdy se zjistí, že pro dané variabilní místo neexistuje enzym...

7. Restrikční metody: PCR-RFLP PCR-RFLP – jak vybrat restrikční enzym: • např. v programu BioEdit: vybrat konkrétní sekvenci → Sequence→Nucleic Acid → Restriction Map druh A druh B

8. Restrikční metody: PCR-RFLP PCR-RFLP - vlastní provedení: restrikční reakce: • s enzymy pracovat na ledu, respektovat manuál od výrobce! • u některých enzymů lze štípat přímo PCR produkt, u jiných je potřeba PCR produkt před restrikcí purifikovat PCR clean-up kitem • ~0.1-1 µg PCR produktu + 5-20 U restr. enzymu + příslušný reakční pufr daného enzymu • enzymy se liší optimální teplotou restrikce: 37° nebo 65° • inkubace (1-)4 h (-přes noc) • některé enzymy poté možné tepelně inaktivovat (80-85° - 15 min) • pozor na star activity - nespecifické štěpení i mimo cílové oblasti RE: • míru SA lze zjistit v např. materiálech od výrobce, způsobena např. nevodným reakčním pufrem • někdy problém, když se produkt v 1 reakci štěpí více enzymy, které se liší optimálním reakčním pufrem

9. Restrikční metody: PCR-RFLP PCR-RFLP - vlastní provedení: • vizualizace na PAA nebo agarozovém gelu (1.5-3% agaróza, post-staining) • agaróza - designovat tak, aby nejmenší fragmenty byly alespoň (50-)100 bp, menší fragmenty jsou obtížně detekovatelné, případně splývají s dimery PCR primerů • PAA - daleko větší senzitivita, teoreticky rozliší 1bp rozdíly v délce s čím počítat při interpretaci: S. echinosperma S. rubra nedoštípaný původní PCR produkt nespecif. PCR produkty (ne produkty restrikce!) kratší fragmenty jsou vždy méně intenzivní (protože mají méně bází které můžou svítit na gelu) dimery primerů (ne produkty restrikce!) PCR-RFLP agarozový gel: cpDNA úsek (rpoC1), enzym PdmI, Spergularia echinosperma a S. rubra – Pavel Kúr

10. Restrikční metody: PCR-RFLP Hybridizace Cardamine enneaphyllos a C. glandulifera jaderná rDNA (ITS): aditivní pattern u hybridů (kombinuje bandy z obou rodičů) cpDNA: hybridi s patterny obou druhů = obousměrná hybridizace (jako ♀ rostliny při hybridizaci C. enneaphylos i C. glandulifera) Lihová J., Kochjarová J., Marhold K. (2007): Hybridization between polyploids Cardamine enneaphyllos and C. glanduligera in the West Carpathians: evidence from morphology, pollen fertility and PCR-RFLP patterns. – Preslia 79: 101-125.

11. Restrikční metody: PCR-RFLP Výhody PCR-RFLP • ušetření peněz za sekvenaci → umožňuje analyzovat relativně velký počet vzorků • kodominantní (u biparentálně děděných markerů – tj. neplatí u cpDNA) Nevýhody PCR-RFLP • nemusí existovat vhodný enzym • menší detekční schopnost: • nemusí odhalit jinou sekvenční variabilitu než cílová místa použitého enzymu • odlišné sekvence vygenerují identický banding pattern (pokud se liší v oblastech mimo cílové místo enzymu)

12. Restrikční metody – studie společenstev Využití restrikčních enzymů při studiu společenstev • např. pro molekulární studie složení společenstev mikroorganismů mykorrhizní společenstva cyanobacterial mats

13. Restrikční metody – studie společenstev Využití restrikčních enzymů při studiu společenstev Izolace celkové DNA vzorku ↓ PCR amplifikace úseku, který slouží jako marker (= umožňuje rozlišit taxony společenstva, primery specificky amplifikují pouze zkoumanou tax. skupinu; prokaryota – 16S, eukaryota – LSU, SSU nrDNA) ↓ Analýza směsi molekul PCR produktu klonování PCR produktu: 1 klon = 1 molekula PCR prod. = informace z 1 jedince společenstva sekvenace klonů, nebo jejich PCR-RFLPanalýza × stále urč. liminace rozsahu analýzy: na 1 vzorek reálné analyzovat desítky až stovky klonů PCR-RFLP jednotlivých klonů: každý unikátní banding pattern hodnocen jako samostatný ´druh´, případně možné klony dodatečně ověřit/analyzovat sekvenací

14. Restrikční metody – studie společenstev Využití restrikčních enzymů při studiu společenstev Izolace celkové DNA vzorku ↓ PCR amplifikace úseku, který slouží jako marker (= umožňuje rozlišit taxony společenstva, primery specificky amplifikují pouze zkoumanou tax. skupinu; prokaryota – 16S, eukaryota – LSU, SSU nrDNA) ↓ Analýza směsi molekul PCR produktu T-RFLP: PCR produkt fluorescenčně značen, štěpen exonukleázami a vizualizován fragmentační analýzou klonování PCR produktu: 1 klon = 1 molekula PCR prod. = informace z 1 jedince společenstva sekvenace klonů, nebo jejich PCR-RFLP analýza

15. Restrikční metody – studie společenstev Princip T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) PCR s fluorescenčně značenými primery – ideálně oba primery a každý jinou barvou • štěpení restrikčními endonukleázami - když se použijí oba primery značené, z 1 molekuly templátu vznikají 2 různě obarvené terminální fragmenty – T-RFs RE (´vnitřní´ fragmenty nenesou fluor. barvivo → nebudou detekovány) • fragmenty denaturovány zahřátím a formamidem → vznik ssDNA fragmentů → separace a vizualizace T-RFs fragmentační analýzou(FA) v kapilárním sekvenátoru FA (píky – produkty primerů značených modrou a zelenou barvou)

16. Restrikční metody – studie společenstev Optimalizace a úskalí T-RFLP • nejdříve nutné zvolit vhodně variabilní marker (úsek pro PCR amplifikaci): • optimální je otestovat více různých úseků, klonovat a sekvenovat produkty jejich amplifikace na vlastních cílových vzorcích • případně použít sekvence z databází • jak vybrat vhodný RE? • opět na základě klonovaných sekvencí, in silico testovat více enzymů • ideální je převzít již publikovanou metodiku (primery + RE atd.) fungující pro dané studované společenstvo... (např. 16S pro bakterie)

17. Restrikční metody – studie společenstev Optimalizace a úskalí T-RFLP • PCR bias: některé molekuly se snadněji (preferenčně) amplifikují, pro omezení bias se doporučuje minimalizovat počet PCR cyklů (pozn.: platí i pro analýzu klonováním) • pseudo-T-RFs: artefaktní jednovláknové molekuly, tvoří píky při fragment. analýze • někdo pro jejich odstranění před fragment. analýzou prosazuje ošetření vzorku Mung Bean exonukleázou (selektivně rozštěpí ssDNA) • radši nepoužívat endonukleázy které tvoří 5´ overhangs – fragmenty mohou být nekonzistentně ovlivněné zbytkovou aktivitou PCR polymerázy → víc artefaktních píků: 5´-nnnnnn - 3´ 3´-nnnnnnGA - 5´ 5´-nnnnnn - 3´ 3´-nnnnnnGA - 5´ +C´ +CT Taq polymerase 5´-nnnnnn - 3´ 3´-nnnnnnGA - 5´ 5´-nnnnnnC - 3´ 3´-nnnnnnGA - 5´ 5´-nnnnnn - 3´ 3´-nnnnnnGA - 5´ 5´-nnnnnnCT - 3´ 3´-nnnnnnGA - 5´

18. Restrikční metody – studie společenstev Hodnocení T-RFLP dat • nutné stanovit tzv. bins – rozmezí velikosti fragmentu (bp), píky v daném intervalu hodnoceny jako T-RF - ´druh´ • názory na optimální šířku binů různé • ideálně ověřit konzistenci píků - replikáty př.: bin width ±1 bp • vytvoření binární matice přítomnosti/absence každého konkrétního T-RF (0/1 data) • některé studie využívají i kvantitativní přístup - odhad četnosti T-RFs z výšky píku • ´druhová´ data – ordinační metody, indexy diverzity apod.

19. Restrikční metody – studie společenstev Výhody T-RFLP • detekuje i nízce abundantní ´druhy´ (ale problém thresholdem – co ještě považovat za pík) • citlivější než běžná RFLP – rozliší délkový polymorfizmus v počtu jednotl. bází • levnější a časově úspornější než klonování • pravděpodobně přináší více informace Neýhody T-RFLP • detekované píky - ´druhy´ jsou anonymní, prakticky je nelze dále sekvenovat • podobně jako u ostatních RFLP metod může odlišná sekvence generovat stejný pattern + metoda nemusí rozlišit všechny sekvenční typy • předpokladem je, že analyzované patterny skutečně pochází ze studované skupiny (značné požadavky na specifitu primerů)

20. Studie společenstev - DGGE DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, nerestrikční metoda) • PCR produkt přímo analyzován na denaturačním PAA gelu s gradientem močoviny nebo formamidu • jednotlivé sekvenční typy separovány na základě odlišnosti vlastní sekvence - GC obsah ovlivňuje rychlost denaturace • bandy lze z gelu vyříznout a přímo sekvenovat