LIPÓLISIS

1. LIPÓLISIS Licenciada Mónica Campanaro INTI Lácteos Rafaela Agosto 2004 INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

2. Hidrólisis enzimática de la materia grasa que produce acumulación de ácidos grasos libres ( FFA ) y provoca la aparición de rancidez en la leche y en los productos lácteos. Sustrato Glóbulo de Grasa Lipasas Enzima INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

3. ¿QUÉ SON LAS LIPASAS? L I P O L I T I C O F L A V O R INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

4. CLASIFICACIÓN • Naturales: propias de la leche • Leucocitarias: secretadas por las células somáticas • Microbianas: secretadas por la flora psicrótrofa INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

5. LIPASAS NATURALES: • Secretadas por las glándulas mamarias • Son termolábiles • pH óptimo entre 8 y 9 • Se inhiben en condiciones a altas concentraciones de: sales, AGL y proteínas • Atacan preferentemente las posiciones extremas del glicerol → AGLs producidos son ricos en AGs de cadena corta INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

6. LIPASAS MICROBIANAS • Provienen esencialmente de bacterias psicrótrofas (principalmente P. Fluorescens) • Su producción se ve favorecida por la presencia de caseínas y proteínas del lactosuero • pH óptimo entre 8 y 9, 50% de activiadad al pH de la leche • Temperaturas óptimas de acción entre 30 y 40ºC • Atacan preferentemente los triglicéridos homogéneos, con AG de cadena corta o insaturadas INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

7. SUSTRATO Glóbulo de Grasa ↓ Triglicéridos protegidos por una “membrana” INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

8. TIPOS DE LIPÓLISIS 1) LIPÓLISIS INDUCIDA Cuando la leche cruda se somete a tratamientos físicos o químicos que rompen la membrana del glóbulo de grasa y facilitan el acceso de la lipasa a los triglicéridos. Este tipo de tratamientos se denominan de “Tratamientos de activación” y se producen durante y después del ordeñe. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

9. a) Tratamientos de Activación: • Agitación y formación de espuma • Cambios de temperatura • Homogenización • Procesos de congelación y derretimiento INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

10. b) ¿Cómo afecta la temperatura a estos tratamientos? • Durante la activación: a menor temperatura más resistencia a la activación  mantener la leche refrigerada • Durante el almacenamiento: una vez activada mantener la leche a bajas temperaturas. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

11. c) Problemas en el tambo • Ordeñadoras:diseños inadecuados y poco mantenimiento Entrada de aire en pezoneras Juntas que pierden Agujeros y rajaduras en tubos de goma Bajos caudales de leche Favorecen entrada de aire → lipólisis INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

12. Cañerías : mayor activación a mayor longitud y número de juntas Tanque de enfriamiento : formación de espuma, caída de la leche al tanque ⇒ baja activación Bombeo: Utilización de bombas centrífugas debajo de su capacidad y admisión de aire a través de juntas defectuosa ⇒alta activación c) Problemas en el tambo INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

13. Almacenamiento la cantidad de lipólisis aumenta con el tiempo y la temperatura de almacenamiento La velocidad a la cual ocurre la lipólisis va disminuyendo pero no se frena completamente hasta la inactivación de la lipasa ( pasteurización ). A mayor tiempo de almacenamiento mayor es la posibilidad del crecimiento bacteriano que también contribuye significativamente a la lipólisis c) Problemas en el tambo INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

14. - no es determinante y está asociada al pasaje de la leche por las bomba - debe ser refrigerado d) Problemas en el transporte INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

15. e) Problemas en fábrica • Excesivo bombeo → alta agitación y mezcla con aire • Desnatado → activación por cambios de T ↳ daño mecánico • Mezcla de leche cruda con leche homogenizada • Refrigeración deficiente • Largos tiempos de almacenaje INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

16. TIPOS DE LIPÓLISIS 2) LIPÓLISIS ESPONTÁNEA • cuando la leche presenta lipólisis en forma natural sin ningún tipo de activación • Se las denomina “leches naturalmente activas”, “leches susceptibles” o “leches espontáneas” • Leches “normales” son las que no presentan lipólisis espontánea • Porcentaje de vacas en un tambo que producen leche espontánea se estima entre 3 y 35% INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

17. a) Características de leche espontánea: INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

18. Alimentación y estado nutritivo Estado de lactancia Estación del año b) Factores relacionados a la vaca Raza Mástitis Producción de leche y de grasa INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

19. TIPOS DE LIPÓLISIS • 3) LIPÓLISIS MICROBIANA • Producida principalmente por bacterias psicrótrofas, cuya característica es crecer a bajas temperaturas ( ej. Pseudomonas ) • Las lipasas microbianas pueden atacar al glóbulo de grasa intacto • Muchas de ellas son termorresitentes, no se inactivan por procesos de pasteurización y pasan a los productos lácteos donde producen rancidez INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

20. LIPÓLISIS EN PRODUTOS LÁCTEOS INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

21. ¿ Por qué nos interesa estudiar la lipólisis ? • La lipólisis produce ácidos grasos libres , que junto a otros compuestos, son los responsables del aroma y sabor de la leche y productos lácteos • Según la naturaleza y la cantidad de estos AGLs se producen defectos del flavor. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

22. Contribución de los sitemas enzimáticos a la lipólisis de los productos lácteos AGL en productos lácteos Lipólisis pre-manufactura: AGL provinientes de la leche Inducida – Espontánea • Lipólisis post-manufactura: • AGL desarrollados en los productos. • Crecimiento microbiano. • Pobre Higiene. • Actividad de enzimas termorresitentes INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

23. Defectos del flavor: C4 – C12 responsables del flavor lipolítico C10 yC12 Sabor jabonoso C4 al C8 Sabor rancio INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

24. Ácidos Grasos Libres: • Ácidos débiles que se distribuyen en la leche y en los productos lácteos según su solubilidad y la cantidad de agua del producto. • En los procesos tecnológicos: • los AGL de cadena corta siguen la fase acuosa • Los de cadena larga se van con la grasa INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

25. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

26. Leche comercial - la lipólisis no parece ser un tema importante - Aparece sabor rancio en valores de BDI > 1.5 - A bajos niveles la rancidez hidrolítica en estos productos se aprecia organolépticamente como sabor a viejo, sucio o sabor a vaca. - A altos valores los defectos se perciben como sabor a cabra, amargo, butírico y rancio - Otros off flavors ( como oxidado ) pueden enmascarar bajos niveles de rancidez. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

27. Crema y Manteca - la crema presenta valores de BDI mayores a los de la leche. - si la leche utilizada en la producción es rancia, los AGL responsables de la rancidez se van parcialmente con el agua. - generalmente la lipólisis desarrollada es post-manufactura - La sal inhibe la acción de las lipasas - Los defectos se perciben como sabor a sucio, amargo, rancioy aceitoso - Otros off flavors ( como oxidado ) pueden enmascarar bajos niveles de rancidez. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

28. Quesos - Los AGL contribuyen en gran parte al flavor característico de muchos tipos de quesos. - El grado de “aceptación” de esa lipólisis depende del tipo de quesos -Generalmente presentan lipólisis de post-manufactura debido al agregado de enzimas lipolíticas o a la adición y crecimiento de microorganismos productores de enzimas lipolíticas INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

29. Sin agregado de agentes generadores de lipasas: características organolépticas poco pronunciadas, por ej. quesos blandos y semiduros C L A S I F I C A C I Ó N Con agregado de lipasas fúngicas: aroma y sabor pronunciados, por ej. Roquefort, Stilton, Camembert Con agregado de lipasas gástricas o naturales: características organolépticas bien marcadas, por ej. Quesos duros italianos como Parmesano, Romano, Provolone INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

30. Cuándo consideramos rancidez en un queso? - Dependerá del tipo de queso y se apreciará organolépticamente, estableciéndose una relacíón entre BDI y umbrales de percepción de rancidez. - Excesivos valores de AGLs dan sabores rancio, sucio o butírico. - La rancidez será responsabilidad de las lipasas bacterianas ya que las naturales de la leche se inactivan en las condiciones de pH y contenido de sal del queso. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

31. CONSECUENCIAS TECNOLÓGICAS • Dificultad en el batido de la crema • Pérdida de grasa en el suero de manteca • Inhibir las bacterias de starters por FFA (leches fermentadas o cultivadas) • Retardar y debilitar acciones del cuajo • Disminuye el rendimiento quesero • Baja la capacidad del espumado de la leche INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

32. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE AGLs INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

33. Generalidades: • No existe un método de Referencia • Los métodos se pueden clasificar en: • Determinan la “acidez global”⇒ Métodos de rutina • Determinan individualmente cada AGL ⇒ métodos cromatográficos. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

34. Generalidades: • Expresión de los resultados: mmol/100g de grasa ó mmol/l ⇓ • Depende del método utilizado • Métodos de aislación de los AGLs: Desestabilizan la emulsión y separan la grasa: BDI Extracción con solventes orgánicos:métodos cromatográficos, Deeth INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

35. Aspectos a tener en cuenta en el análisis de AGLs: • 1)Prevención e inhibición de la lipólisis: • Inhibición química→ no es la más adecuada, existen ejemplos de uso de Dicromato y H2O2. • Inactivación térmica→ se inactiva térmicamente la lipasa. Ejemplos: termisar las muestras hasta 72ºC en un baño y dejarlas 15s una vez alcanzada la T. • Inhibición físico-química→ se mezcla la muestra con la mezcla extractiva. Por ej.:en métodos con extracción con solventes, la grasa y los AGLs se extraen con una mezcla nopolar ácida ( la lipasa se inactiva a bajos pH ). INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

36. 2) Aislación de los AGLs: Método del batido Aislación de la grasa como tal Método BDI Método de Frankel y Tarassuk Extracción usando solventes orgánicos Método de Dole Método de Deeth Uso de ácido Salicílico INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

37. 3) Determinación de los AGLs: Determinación de la acidez global Determinación de los AGL individuales Titulación Métodos Cromatográficos: GLC, HPLC Cambio de color en un indicador Análisis directo de los AGL Formación de complejos coloreados Análisis de los éstres metílicos INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

38. Método de Deeth • Se aplica a leche fluída y leche en polvo • Procedimiento: • 3 ml de leche + 10 ml mezcla ( Isopropílico:Epetrólero:H2SO4 4N) + 6 ml EP + 4 ml de H20 • Se agita 15 seg y se deja en reposo 4 minutos • se toman 5 ml de la capa superior • Se agrega fenolftaleína • Se titula con KOH metanólico 0.02 N INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

39. Cálculos: ųequivalentes/ml de leche = V tit * N * 1000 P*Val donde Vtit = Volumen del titulante N = Normalidad del titulante P= Volumen alícuota/ Volumen capa supeior Val = Volumen de leche utilizada INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

40. Método del BDI • Acidez Titulable de la Grasa: es la cantidad de álcali requerida para neutralizar los ácidos grasos libres contenidos en una masa de grasa presente en la muestra. Se expresa en: mmoles de álcali/100 gr. de grasa. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

41. Método del BDI • Principio: Una cantidad de muestra (leche, crema, dulce de leche, queso) es mezclada cuidadosamente con una solución conteniendo Tetrafosfato de sodio y un agente tensioactivo, y calentando en un baño de agua hirviendo para separar la grasa. • Una cantidad medida de grasa es disuelta en un solvente orgánico y titulada con álcali alcohólico. • Precisión del método: 0.2-2 mmoles /100 gr. de grasa. • Repetibilidad: 0.05 mmoles/100 gr. de grasa. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

42. - En un butirómetro para crema o queso cerrar uno de los extremos y llenar con 16  0.5 ml de leche + 4.5  0.1 ml de reactivo de BDI.- Cerrar y homogeneizar en ángulos de 180 º por 10 veces.- Ajustar la escala con el tapón inferior.- Colocar en Baño María a 95 ºC durante 15 minutos hasta separación de la grasa. - El agua debe estar por arriba del nivel de la muestra.- Pasar a un Baño de 45 ºC hasta que la grasa alcance 45 ºC. Método del BDI Separación de la grasa INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

43. Método del BDI Titulación - 0.25 gr. de grasa + 5 ml de Fat solventTitular con sn. valorada de TBHA 0.01 M hasta viraje de amarillo a verdoso en ausencia de CO2. BDI = 100 x V x C = mmoles/100 gr. de grasa masa muestra INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

44. Método Cromatográfico de Deeth • Se aplica a leche y productos lácteos • Se determinan los AGL sin previa esterificación • Se extraen los AGL con mezcla ácida de Eter étílico y Hexano • Se agrega estándar interno ( C5 ) • La separación de los AGL se realiza pasando el extracto etéreo en columna de alúmina desactivada, los AGL quedan adsorbidos a la alúmina. • Los AGL se desorben de la columna mediante el agregado de una mezcla de éter isopropílico con 6% de ácido fórmico. • Se inyecta al GLC. INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004

45. Métodosparadeterminaciónde AGLs INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004