Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie

1. Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie Blockpraktikum Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 2004/2005 Bianca Löhr

2. Übersicht • Einführung • Probleme und Lösungsmöglichkeiten • Möglichkeiten der Überexpression • Expressionssysteme in E.coli • Affinitätschromatographie

3. Einführung • In der Molekularbiologie werden oft größere Mengen an nativem Protein benötigt Analyse der Funktion, Struktur etc. • Überexpression bedeutet erhöhte Expressions- bzw. Transkriptionsrate eines Gens • Auch verwendet für: vermehrte Bildung eines bestimmten Proteins über die natürliche Konzentration hinaus

4. Einführung • Homologe Genexpression  Expression im endogenen Wirt • Heterologe Genexpression  Expression in fremden Wirtssystemen

5. Einführung • Natürlich auftretende Überexpression als Antwort auf unterschiedliche Milieubedingungen • Nahrung, Temperatur etc. • Immer induzierbare Expressionssysteme • Künstliche Überexpression • Nutzung von regulierbaren Promotoren aber auch von konstitutiven Systemen • Es existieren viele Expressionssysteme für z.B. Bakterien, Pilze, Hefen, Höhere Pflanzen und Tiere

6. Probleme und Lösungsmöglichkeiten • Bei der Überexpression können Probleme auftreten die durch das jeweilige Protein bedingt sind • Proteine wirken teilweise toxisch • Proteine werden abgebaut  Proteolyse • Es treten niedrige Expressionsraten, Lyse und Absterben der Zellen auf • Verminderung dieser Auswirkungen durch: • Niedrige Kultivierungstemperaturen, kurze Induktionszeiten • Einsatz proteasedefizienter Wirtsstämme • Veränderungen des N-Terminus

7. Probleme und Lösungsmöglichkeiten • Codonverteilung: • Die Codonverteilung in unterschiedlichen Organismen ist verschieden • Die Bevorzugung best. Triplettkombinationen führt zu unterschiedlichen Konzentrationen der zugehörigen tRNAs • Die Translation eines fremden Gens mit anderen Codons ist erschwert • Anpassung der Codons an die des Wirtes durch Mutagenese • Co-Überexpression bestimmter tRNAs

8. Probleme und Lösungsmöglichkeiten • Posttranslationale Modifizierung eykaryontischer Proteine  Glycosilierung, Phosphorylierung, etc. • Modifizierung ist im Wirtssystem verändert oder fehlt Nutzung von möglichst nah verwandten Expressionssystemen

9. Probleme und Lösungsmöglichkeiten • Bildung von Disulfidbrücken • Bei Prokaryonten extracellulär bzw. im Periplasma • Bei Eukaryonten im ER, nicht im reduzierenden Cytoplasma • Eukaryontische Gene aggregieren bei cytosolischer Expression • Transport in ein oxidierendes Zellkompartiment muss gewährleistet sein

10. Probleme und Lösungsmöglichkeiten • Aggregation und Bildung von Inclusion Bodies bei Überexpression von hydrophoben Proteinen • Proteine liegen nicht mehr in nativer Form vor • Verminderung durch:  Limitierte Induktion, niedrige Temperatur, Gabe von nicht-metabolisierbaren Glucose-Homologon, Fusionsprotein, Überexpression von Hitzeschock-Proteinen

11. Möglichkeiten der Überexpression • Überexpression als Inclusion-Body-Protein • Nur bei guter Renaturierung des Proteins • Vorteile: hohe Konzentrationen möglich (bis 50% des Gesamtzellproteins) und einfache Aufreinigung

12. Möglichkeiten der Überexpression • Überexpression als Fusionsprotein • Fusion mit Proteinen bzw. Proteindomänen • Fusion mit kurzen, endständigen Peptiden: tags • Vorteile: Verringerung von Toxizität, Proteolyse, Aggregation, Effiziente Aufreinigung mit Affinitätschromatographie

13. Möglichkeiten der Überexpression • Häufig verwendete Fusionspartner-Proteine und Tags

14. Möglichkeiten der Überexpression • Reinigungsschema für GST-Fusion

15. Möglichkeiten der Überexpression • Spaltung der Fusionspartner • Chemisch: Hydrolyse der Peptidbindung • Enzymatisch: z.B. durch den Xa-Faktor

16. Expressionssysteme in E.coli • Eine hohe konstitutive Expression beeinträchtigt meist den Zellmetabolismus • Daher Anwendung von induzierbaren Expressionssystemen • Promotor-Operator-System • Induktion durch Metabolitzugabe, Entfernen best. Kohlenstoffquellen, Temperaturveränderungen

17. Expressionssysteme in E.coli • Häufig genutzte Promotoren in E.coli

18. Affinitätschromatographie • Prinzip: • Spezifische und reversible Adsorption eines Moleküls an einen individuellen, matrixgebundenen Bindungspartner • Selektive Adsorption aus einer komplexen Mischung

19. Affinitätschromatographie • Schema Affinitätschromatographie

20. Affinitätschromatographie • Durchführung: • Adsorption der Probe: Bindungskonstante des Proteins  von 10-5 bis 10-7 M • Waschen: Entfernung unspezifisch gebundener Komponenten durch erhöhte Ionenstärke • Desorption: spezifisch oder unspezifisch • Regeneration der Matrix: richtet sich nach der Verunreinigung der Ausgangsprobe

21. Affinitätschromatographie • Schema Matrix

22. Affinitätschromatographie • IMAC = immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie • Basiert nicht auf biospezifischen Erkennungsmechanismen

23. Affinitätschromatographie • Prinzip: • Metall-chelatierte Gruppe ( bei uns NTA) ist am Säulenmaterial immobilisiert • Ein multivalentes Übergangsmetall-Ion (bei uns Nickel) bindet an das NTA • Interaktion mit den Histidinresten des His-tags • Desorption durch Gradientenelution mittels Imidiazol  kompetetive Verdrängung

24. Affinitätschromatographie • Bindung von zwei Histidinresten an die Ni-NTA-Gruppe