Ellenanyag proteomikai platform

1. Kiválastott antitest jelölt B A Klónozás és nagy mennyiségű (mg) antitest előállítása Ellenanyag proteomikai platform 2.5 O B E K O N 2.0 Immobilizált mAb 1.5 Kádas János1, Mariana Kuras2Élesné Tóth Katalin1, Tajcs Veronika1, Pál Angéla1, William Hempel2, Nadege Tardieu2, Anne Jullien2, Carole Malderez2, Yan Kiefert2, Paco Samb2, Guttman András2 , Takács László1,2 Kovalens keresztkötés Protein G tölteten 1.0 Hat mérés VmaxN átlaga ugyanazzal a plazma „tracer”-rel ugyanazon a napon (a 6 különböző mérés VmaxN SD-je) Immunoaffinitás capture assay A hibridómák eloszlása: |Ratio X/Y| <1.5 97.7% 2>|Ratio X/Y| >1.5 2.2% |Ratio X/Y| >2 0% 0.5 In-solution tripszinesemésztés IMMUNOGÉNEK ELŐÁLLÍTÁSA, HIBRIDÓMA FELÜLÚSZÓK SZŰRÉSE 0.0 Antigen azonosítás nano-LC-MS/MS-sel 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 A „CAPTURE” SZŰRÉSI „ASSAY” REPRODUKÁLHATÓSÁGA HIBRIDÓMÁK SZŰRÉSE: „CAPTURE ASSAY” TÖBB LÉPÉSES MINTAELŐKÉSZÍTÉS AZ IMMUNOGÉN ELŐÁLLÍTÁSÁHOZ 1BioSystems International Kft, Debrecen, Magyarország 2BioSystems International SAS, Evry, Franciaország Hat mérés VmaxN átlaga ugyanazzal a plazma „tracer”-rel különböző napokon (a 6 különböző mérés VmaxN SD-je) Több betegből gyűjtött plazma keveréke K.LPECEAVCGKPKNPANPVQR.I EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS: Munkánk során beállítottunk egy munkafolyamatot natív fehérjék komplex keveréke elleni monoklonális antitestek előállítására, nagy áteresztőképességű szűrésére és a megfelelő fehérje biomarkerek azonosítására (1. ábra). A vérplazmában található fehérjék koncentráció eltéréseinek csökkentése érdekében egy két lépéses plazma depléciós eljárást állítottunk be. Mindezekre a vérplazma nagy komplexitása (közel 10000 teljes méretű fehérje jelenléte) mellett jelentkező óriási reprezentációs különbségek miatt van szükség. A tömegspektrometriás minőség-ellenőrzés eredmények azt mutatják, hogy a két depléciós lépés hatékonysága teljes mértékben megfelel a kívánalmaknak, az eddig- előző munkáink során- tapasztalt eredményeket követi. Erre minden esetben a depletált mintában bizonyos fehérjék megjelenése, illetve eltűnése alapján következtetünk. Jelenleg is dolgozunk a minták széleskörű analízisén és az egészséges populációból származó mintákkal történő összehasonlításán. Az elsődleges eredmények is nagyon bíztatóak, a kezdeti analízis után több olyan fehérjét is találtunk, amelyek specifikusak valamelyik csoportra (2. ábra) A megfelelően előkészített plazmát ezután egerek immunizálásához használtuk fel több ezer hibridóma előállításához, amely a potenciálisan betegség specifikus monoklonális antitesteket tartalmazni fogja. Eddig előállítottunk egy több mint 4000 monoklonális antitestet tartalmazó hibridóma felülúszó könyvtárat obez betegekből származó különbözőképp preparált plazma minták segítségével (3. ábra). A hibridómák több lépéses szűrését a következő munkaperiódusban végezzük el a klinikai mintagyűjteményből kialakított megfelelő betegcsoportok plazmáinak felhasználásával (példa: 4. ábra). A munka folytatatásaként a több lépéses szűrés során kiválasztott, megfelelő antitesteket termelő validált klónok felhasználásával aszciteszek növesztésével nagy mennyiségben állítjuk elő. A tisztított antitestek a Protein ID platformra kerülve adják majd meg az azonosított antigénen keresztül a tényleges betegségspecifikus biomarkert (5. ábra). BEVEZETÉS: Általánosan elfogadott, hogy a II-es típusú diabétesz korai diagnózisa kritikus hatású a megfelelő terápia kiválasztásának, illetve a hosszú távú életminőségre és végül a túlélésre. Az OBEKON konzorcium céljai között szerepel a hazai elhízott populáció molekuláris szintű karakterizálása. A BioSystems International kutatóinak részfeladata a plazmafehérjék ellenanyag proteomikai feltérképezése: 1. Elsődleges cél olyan plazma biomarkerek felfedezése, amelyek megkülönböztetik a diabéteszes obez beteget az obez diabéteszes, illetve a nem obez diabéteszestől 2. A végső cél egy olyan biomarker / diagnosztikum felfedezése, amely előre jelzi a II-es típusú diabéteszt abban a beteg csoportban (obez), akiknél a diabétesz kifejlődésére hajlam van. A Jedlik-támogatás keretében létrejött OBEKON konzorcium tagjaként a BSI monoklonális antitest alapú proteomikai platformját használjuk fehérje biomarkerek kereséséhez. Munkánk során eddig előállítottunk egy megközelítőleg 4000 monoklonális antitestet tartalmazó hibridóma felülúszó könyvtárat obez betegekből származó különböző eljárásokkal preparált plazma minták segítségével. Beállítottunk egy nagy áteresztőképességű szűrési rendszert, amely képes fogadni a hibridómák előállításából származó nagy számú felülúszót, és kezelni azt. Megkezdtük a BSI belső könyvtárából származó egyes antitestek antigén megfelelőinek azonosítását. A kifejlesztett azonosítási platform finomításával lehetővé vált a kóros elhízás specifikus monoklonális ellenanyagkönyvtárból kikerülő potenciális biomarker jelöltek azonosítása is. Poszterünkön az ellenanyag proteomikai platformot, és a projektben vállalt részfeladatok jelenlegi állását mutatjuk be. Egyszeresen depletált plazma (Ig7 Immunoaffinitás kromatográfia) Az abundáns fehérjének megfelelő egyik peptid MS spektruma 84.4 Kétszeresen depletált, normalizált plazma (Poliklonális oszlopkromatográfia) mAb könyvtár 1. ábra: A monklonális ellenanyagkönvtár létrehozásának kezdeti lépései. A plazmakeverékből megfelelő depléciós eljárásokkal immunogént állítunk elő. Az egerek immunizálása és a sejtfúzió után a hibridómákat „capture assay” során szűrjük és a megfelelő adatanalízis során jutunk az elsődleges találatokhoz. A szűrési eljárás reprodukálhatósága tapasztalataink szerint 98% feletti. Scatter Plot 1.9 1.8 1.8 1.7 1.6 BETEGSÉGSPECIFIKUS MONOKLONÁLIS ANTITEST KÖNYVTÁR ELŐÁLLÍTÁSÁNAK GLOBÁLIS MUNKAFOLYAMATA 1.6 AZ IMMUNIZÁLÁSHOZ FELHASZNÁLT PREPARÁTUMOK TÖMEGSPEKTROMETRIÁS ANALÍZISE-”PRIMER BIOMARKEREK” 1.5 1.4 1.4 1.3 1.2 Individuális ELISA-k,Fehérje azonosítás (ID) Plazma preparálás Hibridóma technológia és szűrés Plazma Gyűjtemény 1.1 1.2 1 Obez plazma Kontrol plazma A Jól megválasztott klinikai kollekció 0.9 Depléció, Normalizálásalacsony abundanciájúfehérjék eltávolítása Globális mAB könyvtár készítése Nagy áteresztőképességű szűrés Validálás, Antigén azonosítsa, affinitáskromatográfia és tömegspektrometria (MS) 1 0.8 0.7 LC Normal 0.8 StdDev 0.172 0.296 Min 1.447 0.771 20 26 16 Max 1.901 1.570 Median 1.658 1.063 LC Normal Mean 1.676 1.098 Obez plazma Kontrol plazma B 18 19 14 2. ábra: Venn diagramm:Kontrol donorokból és betegekből származó, egy (A) és két (B) lépésben (Agilent és Normalizáló oszlopkromatográfia) depletált plazmamintákból azonosított fehérjék száma. A mindkét csoportban azonosított fehérjék a diagramm átfedő részében láthatóak. Az egyes mintára specifikusak a diagramm két oldalsó részében jelennek meg. NAGY ÁTERESZTŐKÉPESSÉGŰ ANTIGÉN AZONOSÍTÁSI PLATFORM SZŰRÉSI EREDMÉNYEK 84.4 egyedi„capture assay” Azokat a hibridómákat, amelyek statisztikusan szignifikáns különbséget mutatnak a rákos betegek, illetve klinikailag megfelelő egészséges önkéntesek plazmái között „capture” ELISA mérés során, az ábrán pirossal jelöltük (20 egyedi plazma keveréke). A jelölt hibridómát (84.4) klónoztuk és egyedi „capure” mérés során teszteltük. Eredmények a 84.4-es számú monoklonális antitest egyedi „capture” esszéiből. Az eredmény világosan tükrözi az 5 rákos beteg illetve 5 egészséges önkéntes plazmái közötti különbséget. 5. ábra: Két immunoaffinitás kromatográfiás eljárás a 84.4-es antitestre, melyet két különböző laboratóriumban készítettünk. Eredményeink azt mutatták, hogy a 84.4-es antitest antigénje a plazma egyik abundáns fehérjéje. Kollaborációs partnerünk a Northeastern University megerősítette ezt az eredményt. 4. ábra: Példa a hibridómák szűrési eredményeinek értékelésére (balra) és az egyedi „capture assay” mérésre (jobbra) a BSI egy másik projektjéből. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK: 1. Az immunogén előállításához használt plazma Az immunogének előállításához a pályázat keretében jutottunk hozzá a betegek és a kontrol csoporthoz tartozó önkéntesek (esetünkben 12, illetve 6) vérplazmájához, melyet az átmeneti időszakban az OBEKON konzorcium biobankja tárolt. A vérplazma preparálása után az egyes betegekből származó mintákból egyenlő arányban keveréket készítettünk, és ezt használtuk az immunizálás során igényelt immunogén előállításához. A kontrol donorok vérplazmájából-hasonló módon- szintén előállítjuk az immunogént, de ezt immunizálásra nem, csak az immunogén minőségellenőrzéséhez, illetve elsődleges, tömegspektrometriás biomarker kereséshez használjuk fel. 2. Immunogén előállítása Az első preparálási eljárás során a plazmában a hét leginkább reprezentált fehérjét (albumin, transzferrin, IgG, IgA, haptoglobin, antitripszin, fibrinogén) távolítottuk el az Agilent cég által forgalmazott immunaffinitás oszlop segítségével. A második, cégünk által szabadalmaztatott eljárás (Normalizáló oszlopkromatográfia) tulajdonképpen az első eljárás folytatása, amely további tisztulást és dúsulást valamint a “normális” plazmafeherjék reprezentációs eltéréseinek csökkenését eredményezi. Ennek megfelelően a betegségspecifikus fehérjék, amennyiben a betegek plazma mintájából indulunk ki, csak dúsulhatnak a szeparálás során, kb. 100-1000-szeres relatív reprezentációs előnyhöz jutva. 3. Immunogén elsődleges proteomikai analízise A tömegspekrometriás analízist megelőzően 50-50 µg beteg és kontrol csoportból preparált Agilent és Normalizált mintát liofilizáltunk, majd a megfelelő pufferben reszuszpendáltuk. A fehérjekeveréket tripszines emésztésnek vetettük alá. A kapott minták mérése nano-LC futtatás után ESI MS/MS készüléken tömegspektrometriás analízissel történt. Két egymástól független futtatás eredményeit összesítve történt a szekvenciakeresés MASCOT keresőprogrammal (Matrix Sciences) MSDB adatbázisban. Az azonosított peptidszekvenciák szűrési kritériuma minimum egy peptidszekvencia, 25 találattal számít szignifikánsnak. 4. Az egerek immunizálása A tervezett 4000-es hibridóma szám eléréséhez 10 egeret immunizáltunk, beteg önkéntesekből származó, plazmaminták felhasználásával, a BSI szabadalmaztatott technológiai platformján preparált immunogénekkel. Az immunizáláshoz 8 hetesnél idősebb Balb/c egereket használtunk. Minden egér négy alkalommal kapja meg az immunogént 10-10µg mennyiségben. A második és harmadik immunizálás után 4 nappal 100 µl vérvétellel igazoljuk az antitest termelését az egyes egerekben. A hibridóma generáláshoz később felhasznált egereket a vérükben jelentkező humán plazma fehérje elleni antitest titer alapján választjuk ki, ELISA teszt segítségével. Az ELISA eljárás hasonló módon történik, mint amit lentebb ismertetünk. 5. Fúzió-hibridómák létrehozása A fúziókat a célzott hibridómaszám eléréséhez mérten úgy végezzük el, hogy az immunizált egerek lépsejtjeit konvencionális monoklonális ellenanyag technológia alkalmazásával SP2/Ag0 mielóma partner sejtekkel fuzionáltatjuk, és a fuzionált sejteket plateken tenyésztjük. Minimum három héttel a harmadik immunizálás után az egerek emlékeztető oltást kaptak a megfelelő immunogénnel. Ebben az esetben már nem alkalmazunk adjuvánst. Négy-öt nappal az emlékeztető oltás után a lépet eltávolítjuk, és a B sejtek kinyerése végett homogenizáljuk. Az SP2 sejtekkel történő fúziót 12 db 96-lyukú platen valósítjuk meg. Megfelelő tenyésztési periódus után (minimum 2 hét) a sejteket 24-lyukú platekre rakjuk át és tenyésztjük 2 ml, megfelelő minőségű, antitest tartalmú felülúszó begyűjtéséig. Az egyes klónokból duplikátumot készítünk és -80 ºC-on illetve nitrogénben további felhasználásig tároljuk. 6. Az ellenanyagkönyvtár szűrése Az egyes mono- vagy oligoklonális felülúszókat „capture” ELISA kísérletekben vizsgáljuk, ahol a felülúszóban levő mAb-ot, γ-lánc specifikus és immobilizált poliklonális ellenanyag köti meg, tehát Anti-egér IgG antitest fedett mikrotiter plateket használunk az egér anti szérum IgG kikötéséhez. Ezt követi a biotinált plazma fehérjéket tartalmazó „tracer” bemérése. Az antitestek, melyek felismerik a megfelelő biotinált fehérjéket, kötik azt. A kötött fehérjéket HRP konjugált streptavidinnel inkubáljuk, amely a biotinált fehérjék biotin részéhez kötődik. Az OPD szubsztrát hozzáadásával, rövid inkubációs idő elteltével 490nm-en a színreakció mérhetővé válik, melyet kénsav hozzáadásával állítunk le. Az elkészült könyvtár szűrésének előfeltétele, hogy minden ellenanyag kvantitatív formában tesztelhető legyen az egyes plazma minták ellen. A felülúszók, miután ezeknek a feltételeknek megfelelnek, bele kerülnek az elsődleges szűrési csoportba. A BSI által kidolgozott szűrési platform lépéseit ebben a jelentésben részletesen nem ismertetjük. Megjegyzendő, hogy az eljárás során nagy áteresztőképességű, robotizált ELISA rendszert használunk, a nagy számú minta illetve mérési pont kezelhetősége érdekében. 7. Antigének azonosítása - Protein ID A munka folytatatásaként a több lépéses szűrés során kiválasztott, megfelelő antitesteket termelő validált klónok felhasználásával aszciteszeket növesztésével nagy mennyiségben állítjuk elő. A tisztitott antitestek a Protein ID platformra kerülve adják majd meg az azonosított antigénen keresztül a tényleges betegségspecifikus biomarkert. Az egyes ellenanyagok antigénspecificitását, függetlenül attól, hogy milyen antigén csoporttal reagál, affinitás kromatográfiát követő tömegspektrometriás eljárással határozzuk meg. A platform felépítése szerint egy kétlépéses immunaffinitás kromatográfiából, a szervesen hozzákapcsolódó 1 vagy 2 dimenziós elektroforézisből áll, végül az elektroforézis után egy tömegspektrometriás lépéssel fejeződik be. • REFERENCIÁK: • Biomarker Discovery Platform: PCT/ WO 2005/077106 A2 (Exclusive license from Northeastern University). • Expression Profiling Technology Platform: PCT/IB2005/003397 (BSI fully owned) • Normalization of complex immunogenic analyte mixtures: Provisional 2005 (BSI fully owned) • Protein ID technology, provisional 2007 (BSI fully owned) AZ OBEZITÁS PROJEKT KERETÉBEN ELKÉSZÍTETT FÚZIÓK 3. ábra: A projekt keretében előállított hibridómák száma az eddigi fúziók során és a felhasznált immunogén. A szűrés előfeltétele a megfelelő mennyiségű antitest jelenléte a hibridómák felülúszójában.