ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK

1. ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK

2. Immunaffinitás kromatográfia • ELISA – Enzim kötött immunszorbens esszé ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal a szubsztrát hozzáadását követően ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal az enzimreakció leállítását követően

3. AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE

4. ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék „affinity purified antibody” : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják rákötött antigének

5. A TISZTÍTÁS LÉPÉSEI • Tisztítandó ellenanyagok hozzáadása • Kötődés • Mosás • Elúció

6. ANTIGÉNTISZTÍTÁS oszlop oszlop töltelék hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztítandó oldat felvitele Kötődés Mosás polimer gyöngy Elúció Tisztított antigén

7. IMMUNPRECIPITÁCIÓ • egy adott fehérje izolálása és koncentrálása sok fehérjét tartalmazó mintákból • fehérje kölcsönhatások vizsgálata (pl. jelátvitelben résztvevő molekulák vizsgálata)

8. ELISAEnzyme Linked ImmuneSorbent Assay ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz

9. enzim enzyme linked immune sorbent felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim

10. AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ MENNYISÉGÉVEL ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

11. Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés Antigén AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Indirekt módszer Direkt módszer Primer ellenanyag

12. Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) Primer ellenanyag Antigén AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz

13. Avidin Biotin Complex Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotinált ellenanyag Antigén AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni ABC Egyszerű Jel felerősítése

14. KOMBINÁLT „SZENDVICS”ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvicstechnikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). nem kötődő anyagok kimosása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges fehérjék kimosása felesleges ellenanyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges konjugátum kimosása citokin tartalmú minta hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

15. EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével felesleges antigén kimosása felesleges fehérjék kimosása az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges ellenanyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével specifikus ellenanyagok hozzáadása enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

16. KOMPETITÍV ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása • Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

17. A standard hígítási sora OD Ismeretlen koncentrációjú minta Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? 62 31 16 7.8 3.9 1.9 500 250 125 0 0.97 0.49 0.24 0.12 1000 0.061 0.030 0.015 0.007 0.004 koncentráció Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

18. BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA • hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek • Tumor antigének kimutatása • Citokinek, hormonok kimutatása • doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel

19. Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal (a kit része) fedett felület TUMORDIAGNOSZTIKA • A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában • Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak • Prosztata daganatok • prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben  nem specifikus, de a PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas) • hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

20. AZ ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK immunoblot (Western blot) immunhisztokémia

21. WESTERN BLOT • Lépések: • minta előkészítés (szöveti vagy sejtes) • gél elektroforézis • blotolás • jelölés • előhívás Anode(+) Cathode(-) Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására

22. WESTERN BLOT • Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak • SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) • Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján Protein minta Standard Western blot Membrán SDS-PAGE

23. WESTERN BLOT • Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában • Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Nátrium-Dodecyl Szulfát-Polyacrylamid Gélelektroforézis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják • Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához • Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

24. WESTERN BLOT Kimutatási eljárások: • Kolorimetriás (peroxidáz enzim – denzitometria / spektrofotometria) • Kemilumineszcens (ECL) • Radioaktív (izotóp – RTG) • Fluoreszcens (jelölés – CCD camera)

25. MEGNÖVELT KEMILUMINESZCENCIA /Enhanced chemiluminescence (ECL)/ • H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) • Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba • A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható • A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák • (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer) Immobilizált proteinek Primer ellenanyag Fab Fc Torma- peroxidáz luminol H2O2 h Epitóp a protein felszínén luminol enhancer H2O detektálás Szekunder ellenanyag Membrán

26. IMMUNCITOKÉMIA / IMMUNHISZTOKÉMIA Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban • Immunfluoreszcencia • fluoreszcensen jelzett ellenanyag • FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga) • PE – fikoeritrin (narancssárga) • Immunoenzim módszer • enzimmel konjugált ellenanyag • P – peroxidáz • AP – alkalikus foszfatáz • (a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek)

27. Szövetminta IMMUNHISZTOKÉMIA FIXÁLÁS METSZÉS Festés előtti metszet FAGYASZTÁS

28. IMMUNHISZTOKÉMIA Enzim Biotin • ABC komplex: • biotinált ellenanyag • avidin • biotinált enzim Avidin Szekunderantitest Primer antitest Tárgylemez Sejtek (sejttenyészetek) Szövetmetszet

29. Hagyományos hisztokémia Akut bronchopneumonia (hematoxilin-eozin festés) Viszonylag kevés sejttípus azonosítható

30. Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

31. Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

32. Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC) Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)

33. Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt MitokondriumF-aktin Sejtmag

34. Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt Peroxiszóma MitokondriumSejtmag