Tópicos em bioquímica: DNA E CROMOSSOMOS

1. Tópicos em bioquímica: DNA E CROMOSSOMOS CROMOSSOMOS E SUBDOMÍNIOS CROMOSSOMICOS CONSTITUEM UNIDADES DISTINTAS NO NÚCLEO INTERFÁSICO

2. INTRODUÇÃO • Os cromossomos formam territórios distintos no núcleo interfásico, delimitando domínios formados pelos seus braços • Recentemente, relações espaciais e funcionais tem sido descritas entre domínios e territórios cromossômicos (fábricas de DNA e RNA, fatores de splicing, etc)

3. Territórios cromossômicos e seus domínios: Territórios cromossômicos Domínios cromossômicos

4. Antes de fazer inferências entre estrutura e função da cromatina, deve-se então compreender como é a organização espacial da cromatina. • A QUESTÃO ENTÃO É: OS CROMOSSOMOS NO NÚCLEO INTERFÁSICO ESTÃO SOBREPOSTOS OU FORMAM TERRITÓRIOS MUTUAMENTE EXCLUSIVOS?

5. MATERIAL E MÉTODOS: Cultura das células: As células das linhagens HA-1 e V79 foram incubadas em MEM com Sais de Hanks contendo FCS, glutamina, penicilina, streptomicina a 37 °C e 2% CO2. Marcação das células: A replicação foi marcada com IdUrd (iodo-desoxi-uridina) e com CldUrd (cloro-desoxi-uridina) por meio de dois métodos: • FUSÃO DE NÚLCEOS • MARCAÇÃO SEQUENCIAL

6. Timidinas Análogas: substituição Br I Cl

7. MÉTODO DE MARCAÇÃO I: FUSÃO DAS CÉLULAS Consistiu em obter núcleos com diferentes cromossomos marcados a partir da fusão de núcleos de duas populações de células marcadas diferentemente Plaqueamento das células IdUrd Shake-off +fusão (das mitóticas) CldUrd Núcleo das células fundidas

8. MÉTODO DE MARCAÇÃO II: MARCAÇÃO SEQUENCIAL Na 1ª fase S, IdUrd foi incorporado As células foram lavadas e cultivadas durante uma 2ª fase S em meio contendo CldUrd. As células passaram por uma 3ª fase S sem marcação

9. Esquema da marcação seqüencial:

10. VERIFICAÇÃO DA REPLICAÇÃO MARCADA: Os marcadores foram detectados por anticorpos específicos (originalmente para BrdUrd) e um anticorpo derivado de rato Coloração não-específica foi bloqueada • CONTROLE: As células foram comparadas com células não marcadas e coradas com o marcador de DNA TROPO-3

11. Detecção da marcação por imunofluorescencia: Reconhecem os anticorpos Reconhecem os marcadores

12. VISUALIZAÇÃO E ANÁLISE: Utilizou-se um microscópio de fluorescência e o registro foi feito com uma câmera CCD Foram feitas imagens das fusões e marcações seqüenciais utilizando o CLSM Para determinar se havia sobreposições espaciais realizou-se a marcação com FICT e Texas Red e registrou-se e analisou-se as elevações cromáticas

13. RESULTADOS • O experimento controle mostrou que a morfologia nuclear e a estrutura da cromatina não foi alterada. • Todos os cromossomos foram uniformemente marcados

14. CldUrd (em verde) • Os núcleos fundidos apresentaram um mosaico de domínios com ou outro marcador, com pouca sobreposição. • As bordas entre os cromossomos estavam bem definidas • Confirmando assim a discrição dos territórios e domínios IdUrd (em vermelho)

15. + IdUrd 1ª fase S • A marcação seqüencial revelou um mosaico de domínios distintos contendo exclusivamente IdUrd, CldUrd ou nenhuma marcação. Indicando também a idéia de unidades discretas • Revelou também subdomínios formados por (SCEs) formando um arlequim + CldUrd 2ª fase S 3ª fase S

16. Os sinais utilizados para verificar o cruzamento da área de borda, mostrou que havia limitada sobreposição • Para verificar se ocorria um erro na técnica de visualização foi feito um experimento controle e visualização com linescan

17. Comparações com linescan: Experimento: Controle:

18. Admitiu-se que houve uma pequena sobreposição Sobreposição

19. A Cromatina apresentou regiões semelhantes a fibras que admitiam disposições irregulares e nunca contendo ambas as marcações.

20. DISCUSSÃO • Baseando-se nas duas abordagens amostradas, os territórios cromossômicos são estruturas distintas e contém subdomínios discretos • Os cromossomos podem penetrar em regiões de outros, mas sem se misturar, tomando formas irregulares • Não se pode, porem excluir a possibilidade alguma sobreposição, com pequena quantidade de DNA envolvida

21. Esta parece ser uma característica comum a todos os eucariotos • Nos locais onde ocorreu as SCEs ocorreu súbita mudança de marcação indicando que há um alto grau de compartimentalização nos territórios • Estruturas similares às fibras observadas foram relatadas em estudos in vivo. Onde especula-se que elas possam corresponder a um alto grau de dobramento da cromatina

22. Não se pode, porem excluir a possibilidade alguma sobreposição, com pequena quantidade de DNA envolvida • Processos raros de mistura pode ocorrer em regiões de SCEs ou união de dois domínios (ex: duas fábricas de cromossomos diferentes se unirem). União de domínios (raro)

23. Experimentos com vimentina corroboram com a idéia de territórios • Experimentos com FISH não são tão eficientes pois marcam apenas alguns cromossomos • No leptóteno da espermatogênese poderia ocorrer mistura dos domínios

24. Por fim: • Uma questão sobre este tema ainda permanece: Como as fibras estão organizadas dentro de um território? • Cromatina dobrada e altamente misturada • Subdomínios não se sobrepõem • Teorias de organização funcional (não espacial) • Os resultados do trabalho sugerem que há uma organização estrita da cromatina em unidades discretas, promovendo uma base para elucidar estudos de relações entre estrutura e função.

25. MORAL DA HISTÓRIA: Sua visão de cromatina depois da aula: Sua visão de cromatina antes da aula: