mRNA metabolism

1. mRNAmetabolism

2. CAP

3. m7G CAP lisatakse kõigile RNA pol II produktidele, osadel protsessitakse hiljem maha • mRNA • snRNA • snoRNA • Telomeraasi RNA

4. CAPi funktsioonid tuumas (kompleksis CBC-ga) • mRNA splaisingu aktiveerimine tuumas • mRNA 3´-otsa protsessimise/ polüadenülatsiooni aktivatsioon • snRNAde tuuma-tsütoplasma-tuuma transport

5. CAPi funktsioonid tsütoplasmas • Toob ribosoomid mRNA-le (üle eIF4F kompleksi). See on translatsiooni kiirust limiteeriv etapp. • Kaitseb 5´-3´ suunalise mRNA eksonukleolüütilise lagundamise eest. PABP interaktsioon CAP-ga selleks vajalik.

6. snRNAde edasi tagasi liigutamine • m7G CAP eksporditakse tuumast tsütoplasmasse • Seal toimub m7G topeltmetüleerimine 2. positsioonist trimetüülguanosiin süntaas 1 (Tgs1) poolt • m2,2,7G imporditakse tuuma tagasi • m2,2,7G hoiab RNA tuumas

8. mRNA stabiilsus Inimese rakkudes on enamusi mRNAsid u 6 koopiat raku kohta, vaid väheseid 50-100 koopiat. mRNA stabiilsused varieeruvad alates 100X rakutsüklist lühemast poolestusajast kuni mitme rakutsükli pikkuseni. Paljude mRNAde poolestusajad on reguleeritavad. mRNA stabiilsused: varase vastuse geenid (proto-onkogeenid, tsütokiinid) 10-60 min; majahoidjad (histoonid, hormoonid) u 12 h globiinid, müosiinid, IgG u 24 h. mRNAd siduvad valgud: 1-globaalsed (PABP) 2-grupispetsiifilised (ELAV/Hu) 3-tüübispetsiifilised (IRE). Pärmis 471 annoteeritud RNA-seostuvat valku, millest 312 osalevad RNA protsessingus, modifitseerimistes, splaisingus või lagundamises. Inimeses võib-olla ca 1500 RNA-siduvat valku; palju neist ei tea. Inimeses 30 põhilist hnRNP valku ja palju minoorseid.

9. mRNA lagundamine eukarüootides • 5´ 3´ lagundamine tsütoplasmas • 3´ 5´ lagundamine tsütoplasmas • ARE elemendid- mRNA destabiliseerimine • Lagundamine tuumas • Lagundamine endonukleaasi poolt • NSD- nonstop mediated decay (3´-5´) • NMD- nonsense mediated decay

10. Mechanisms of mRNA turnover Wagner, E. et al. J Cell Sci 2002;115:3033-3038

11. 5´ 3´ lagundamine • mRNA deadenüleerimine 10-15 A-ni (Pop2-Ccr4 kompleks, Pan2-Pan3 kompleks, PARN) • CAPi mahavõtmine (Dcp2-Dcp1 kompleks) • 5´-3´ lagundamine exonukleaasi Xrn1 poolt

12. polüA saba ja degradatsioon • polüA seob valku PABP • PABP interaktsioon polüA sabaga inhibeerib mRNA degradatsiooni (CAP’i eemaldamist) • polüA saba pole vajalik decappimise inhibeerimiseks • Deadenüleeriv ensüüm PARN seondub 5´ CAP’le, see stimuleerib aktiivsust. • Oletatavasti on polüA eemaldamise tingimuseks normaalse mRNA tsirkulariseerimise muutus või kadumine.

13. translatsiooni initsatsiooni inhibitsioon destabiliseerib mRNAd • elongatsiooni inhibitsioon stabiliseerib mRNAd • PAB1 mutatsiooni viivad enneaegseledecappimisele • Mutatsioonid, mis vähendavad decappimist, supresseerivad pab1 deletsiooni letaalsust. • eIF4E ja 4G mutatsioonid tõstavad deadenülatsiooni ja decappimist. • Dcp1 seob eIF4G-d

14. Kuidas PABP kaitseb CAP’i • mRNAd stabiliseeriv ja eIF faktoreid siduvad regioonid erinevad • Valgusünteesi initsiatsioonist sõltumatud PABPi kontaktid CAP’ga • Decappimise inhibitsioon läbi lokalisatsiooni (P body vs. translating ribosomes)

17. mRNA “decaping” polüA lühenemine või eemaldamine mRNA translatsioon peab olema lõppenud mRNA lokaliseeritakse nn. P “body”sse toimub CAP’i eemaldamine

18. 3´ 5´ lagundamine • PolüA lagundamine (PARN) • Tsütoplasmaatiline eksosoom (vähemalt 9 eksonukleaasi) sööb CAPiga mRNA • DcpS hävitab CAP-i järelejäänud lühikese (alla 10 nt) mRNA jupi otsast

19. Imetajate eksosoom koosneb minimaalselt: • 6st RNaas-PH-domääni valgust (PM/SCL75, MTR3, RRP41, RRP42, RRP43 ja RRP46) • 3st S1 ja KH domääni valgust (RRP4, RRP40,CSL4) • RNaasD-sarnasest PM/SCL100 • Helikaas (?) KIAA0053 • Valgust, mida rakutsükli M faasis fosforüülitakse

20. ARE mRNAd A+U rikas element ARE paljude ebastabiilsete mRNAde 3´-UTRs. 3´-5´ degradatsioonirada põhiline. 8% inimese mRNA-dest sisaldavad ARE elemente. Ei ole selge kuidas ARE-siduvad valgud töötavad.

21. ARE-siduvad valgud • AUF1 – destabiliseerib/ kuumaehmatusel stabiliseerib • HuR – stabiliseerib ARE-mRNAd, reguleerib nende tuumaeksporti ja lokalisatsiooni tsütoplasmas • TTP, KSRP, BRF1 - destabiliseerivad

23. Model for how the A+U-rich element mediates stability and instability.   Interaction of the A+U-rich element (ARE) with a destabilizing factor, such as AUF1, might promote rapid deadenylation by reducing the affinity of the poly(A) binding protein (PABP) for the poly(A) tail. Conversely, stabilizing factors, such as HuR, might enhance binding of the PABP to the poly(A) tail, thus blocking deadenylation.

24. mRNA endonukleolüütiline lagundamine • PMR1- polysomal ribonuclease 1 vahendab östrogeeni poolt stimuleeritud üldist seerumivalkude mRNAde degradatsiooni Xenopuse ootsüüdis. • Tunneb ära AYUGA järjestust. • Osaleb ka NMDs erütrotsüüdis (β-globiini mRNA)

26. mRNA lagundamine tuumas • Tuuma eksosoom 3´-5´- unikaalne komponent Rrp6p (pärm). Vajalik snRNA, rRNA, snoRNA, pre-mRNA maturatsiooniks ja RNA degradatsiooniks tuumas. • Rrp6p osaline kvaliteedikontrollil värskelt sünteesitud mRNA vabastamisel transkriptsioonikohast. • Ka tuumaeksosoom võib ARE-mRNAd lagundada

28. NSD- nonstop mediated decay • Polü(A) translatsioon lisab valgule polü(Lys) saba • Ribosoom jääb otsa kinni, seob Ski7 (eRF3 homoloog) • Ski7 stimuleerib ribosoomi dissotsatsiooni ja toob eksosoomi kohale

29. NMD- nonsense mediated decaytoimub kõigis eukarüootides • Enneaegsete stop-koodonitega mRNAd • Upstream ORF in 5´UTR • Liiga pikk 3´UTR • Bitsistroonsed mRNAd • mRNAd kus kasutatakse korraga mitmeid eri raamides start koodoneid

30. NMD on tähtis protsess • 10% pärmi mRNAde tase muutub kui NMD-d inhibeerida • 1/3 imetaja alternatiivsest splaisingust toodab NMD substraate • NMDs inaktiivsed hiire embrüod surevad varsti pärast implantatsiooni • NMDs inaktiivsed blastotsüstid lähevad kultuuris apoptoosi

31. Miks NMD?Pooliku ORFiga mRNAlt peaks transleeritama poolikut valku. Poolikud valgud, mis näiteks on jäänud ilma olulistest domäänidest võivad kahjustada organismi elutegevust töötades näiteks onkogeenidena või viies dominantselt negatiivsele fenotüübile. On teada üle 200 enneaegset stop-koodonit tekitava mutatsiooni, mis põhjustavad haigusi (enneaegse stop-koodoni tekkele viib ka enamus raaminihet põhjustavaid mutasioone). Kui NMD-d ei oleks, oleksid paljud retsessiivsed mutatsioonid dominantse mõjuga (ja põhjustaksidraskemaid haigusi).

32. NMD kohta 2 olulist fakti: 1) NMD toimub enamasti enne kui on katkenud mRNA füüsiline side tuumaga. Enneaegset stop-koodonit sisaldav mRNA molekul, mis juba ilusti tsütoplasmas ujub, pääseb suure tõenäosusega lagundamisest.

33. 2) NMD on alati seotud lagundatava mRNA translatsiooniga. Enneaegset stop-koodonit sisaldava mRNA translatsiooni inhibeerimine stabiliseerib vastavat mRNAd. Konkreetselt on NMD toimumiseks vajalik translatsiooni terminatsioon enneaegsel stop-koodonil (supressor-tRNAd inhibeerivad NMD-d).

34. Translatsioon, mille toimumisest NMD sõltub, initseeritakse sõltuvalt tuumas cap-i siduvatest valkudest CBP80 ja CBP20. Kuna juba peale esimest translatsioonitsüklit vahetatakse need valgud mRNA 5´-cap struktuuril eIF4E vastu, toimub NMD peale esimest ja enne teist translatsioonitsüklit.

35. Imetajas on NMD toimumiseks vaja, et stop koodononile kus translatsioon termineeritakse järgneks rohkem kui 50-55 nt allavoolu intron.

36. Kuid intron splaissitakse välja tuumas enne seda kui ribosoom saab tsütoplasmas stop koodonil termineerida!

37. Tuumas toimuv splaissing jätab 20-24 nt splaisingu toimumiskohast ülesvoolu maha valgulise kompleksi- EJC (exon-junction complex)

40. EJC komponendid

41. ECJ transporditakse tsütoplasmasse, seal eemaldatakse ta mRNAlt esimese translatsioonitsükli käigus.

42. Esimene translatsioonitsükkel (võimalik, et vaid ühe ribosoomi poolt läbi viidud ühe valgumolekuli süntees) toimub arvatavasti veel siis kui mRNA on veel tuumamembraaniga seotud ja on kindlasti seotud CBP80-CBP20 CAPi siduva heterodimeeriga.

43. Upf valgud on vajalikud NMD-ks • Upf3 seob EJC-le tuumas • Upf2 seob Upf3-le transpordil tsütoplasmasse • Kui transleeriv ribosoom EJC-d ära ei korista, toob eRF3 endaga seotud Upf1 kohale • mRNA lagundatakse • Tavaliselt rakus Upf1 hüpofosforüülitud • Upf1 fosforüülimine (SMG1) ja defosforüülimine (SMG6) NMD-ks vajalik

45. EJC ja translatsioon • Splaissitud mRNA pealt sünteesitakse rohkem valku kui identse järjestusega splaissimata (cDNAlt transkribeeritud) mRNA pealt. • EJC valgud (RNPS1, Y14, Magoh) suurendavad translatsiooni saagist kui nad kunstlikult mRNAle siduda. • Splaissitud mRNA on palju enam polüsoomidega seotud kui identne splaissimata mRNA.

46. Pärm ja NMD Pärmis introneid vähe, seal pole ka EJC kompleksi põhikomponente (Y14, magoh, eIF4AIII). Aga NMD toimub Pärmis DSE- downstream sequence element, mis täidab EJC funktsiooni kui asub stop koodonist 3´-suunas

47. Drosophilas asi segane: kuigi kõik EJC komponendid olemas, pole ükski neist NMD-ks vajalik.

49. NMD tsütoplasma vs nukleus • enamus imataja NMD toimub tuumas • tuuma NMD mRMA lagundatakse nukleoplasmas • esimest translatsiooni tsükkel kas tuumas või tuumaga osaliselt seotud mRNAga?

50. NMD ja geeniregulatsioon