Considerazioni sulla creazione di cibridi-stemibridi-chimere

1. Considerazioni sullacreazionedi cibridi-stemibridi-chimere

2. Cellula uovo con nucleo e cromosomi co, mitocondri Spermatozoo con nucleo e cromosomi cs co cs spermatozoo Cellula uovo fecondazione co-cs co cs co cs zigote cariogamia

3. Cellula uovo con nucleo e cromosomi co, mitocondri Spermatozoo con nucleo e cromosomi cs zigote Mitocondri con proprio DNA co-cs Lo zigote possiede informazioni per lo sviluppo del nuovo individuo contenute nei cromosomi di origine materna e paterna: co-cs il patrimonio citoplasmatico in particolare i mitocondri, sono solo di origine materna I mitocondri sono sede delle reazioni che forniscono energia alla cellulaLa loro moltiplicazione, attività, dipendono da un equilibrato, corretto, rapportocon le informazioni che li riguardano, provenienti dal DNA nucleare

4. Mitocondri con proprio DNA, mitocondriale Nucleo con proprio DNA, nucleare Zigote normale Zigote con nDNA e mDNA interspecifici donna1 capra co-cs donna2 pecora Zigote con nDNA e mDNA intraspecifici Per uno sviluppo normale dell’individuo, è necessario che il meccanismoenzimatico di accoppiamento tra le reazioni dipendenti dal genoma nuclearee il genoma mitocondriale siano perfettamente sintonizzate Si sta cercando di comprendere la natura di tale meccanismoanche creando degli ibridi cellulari con genoma nucleare e genoma mitocondrialeappartenenti a specie diverse o uguali (ibridi interspecifici e intraspecifici)

5. Il numero di mitocondri presenti inizialmente (1000…) va riducendosinelle cellule embrionali (5-10…) e poi mediante moltiplicazione vannoaumentando durante le fasi della differenziazione cellulare, istogenesi,organogenesi.Sono indispensabili per la vita della cellula mDNA mDNA mDNA mDNA La trascrizione e replicazione del mDNA sono guidate da fattorimitocondriali, codificati e prodotti dal nDNA , e trasferiti nei mitocondriove interagiscono con sequenze presenti nel mDNA non codificante nDNA La replicazione del mDNA cessa poco prima della fecondazione e riprendeallo stadio di blastocisti matura(nell’uomo: circa 2 miliardi al secondo ! > durata media 100 giorni)

6. cibrido ibrido citoplasmatico,ottenuto inserendo un nucleo(diploide) di cellula somatica in una cellula (denucleata) della stessa specie (cibrido intraspecifico) o di specie diversa (cibrido interspecifico) Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri denucleazione Oocita ricevente, aploide, con propri mitocondri Inserimento nucleo Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nell’ovocitaricevente, al quale è stato asportato il nucleo:lo zigote possiede il DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del ricevente:ibrido omoplastico

7. Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri denucleazione Oocita ricevente, aploide, con propri mitocondri Inserimento nucleo e fusione citoplasmi Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nell’ovocitaricevente, al quale è stato asportato il nucleo:vengono anche fusi i due citoplasmilo zigote possiede il DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del riceventee della donatrice:ibrido eteroplasmatico

8. stembrido ibrido citoplasmatico,ottenuto inserendo un nucleo(diploide) di cellula somatica in una cellula staminale embrionale (denucleata) della stessa specie (stemibrido intraspecifico) o di specie diversa (stemibrido interspecifico) Cellula somatica, diploide, donatrice, con propri mitocondri denucleazione Cellule staminali embrionali riceventi, diploidi, con propri mitocondri Inserimento nucleo in cellule staminali embrionali esistenti Individui appartenenti alla stessa specie: es.donna1, donna2il nucleo di una cellula somatica della donatrice viene inserito nella staminale ricevente, alla quale è stato asportato il nucleo:la nuova cellula possiede il DNA nucleare della donatrice e il DNA mitocondriale del ricevente

9. chimere Chimera: embrione ottenuto disaggregando stadi embrionali precoci neisingoli blastomeri e successivamente riaggregando i blastomeri dispecie diversa in percentuali variabili, allo scopo di studiare la biologiadello sviluppo e la funzione specifica di determinati geni nella genesidi particolari malattie blastomeri1 Impianto in uteromadre adottiva blastocisti blastomeri2 Aggregazione blastomeri

10. In genere si può affermare che il numero di gravidanze a termine e dinati vivi, nel caso di cibridi interspecifici, si verifica solo all’interno dellostesso genere (tra bovini, tra ovini, tra equidi, tra felini) Negli altri cibridi di diverso genere, si arriva al massino allo stadio di blastocisiti:es.mucca+cavallo, coniglio+macaco > blastocisiti es.mucca+balena , maiale+coniglio << blastocisiti Probabile cibrido ottenuto inserendo nucleo di linfocita umano in oocita denucleato di bovino > linea staminale embrionale umana Inserimento di nuclei di cellule somatiche umane , di vario tipo, in oociti denucleati di anfibio( rana, xenopus) > riprogrammazione e riattivazione delgene OCT-4 indicatore della potenzialità staminale richiamata nel nucleo somatico differenziato Importante riuscire a comprendere il meccamismo biochimico presentenel citoplasma degli ovociti, capace di riprogrammare il DNA nucleare dellecellule somatiche, differenziate Sembra ormai certo che la riattivazione del sistema mitocondriale dipende dal corretto trasferimento degli elettroni della catena respiratoria e questo in funzione di 13 proteine, 2 rRNA, 22 RNA mitocondriali e 67 prodotti codificafi nel DNA nucleare

11. Lo sviluppo embrionale risulta controllato inizialmente solo dal corredocitoplasmatico ovulare (materno) mediante RNA messaggeri prodottidall’oocita: il genoma dello zigote si attiva solo allo stadio di 2 blastomeri (topo),4 blastomeri (uomo), 8 blastomeri (bovini, caprini). Cibrido : nucleo somatico umano > oocita animale a blastocisti avanzata, predominano prodotti genici umani, essendo statiormai degradati quelli animali presenti nell’oocita ricevente, eccettopoche eventuali proteine Importanza delle ricerche su ibridi interspecfici e intraspecifici a livello umano Ottenere linee di cellule staminali riprogrammando cellule somatichecome se fossero staminali embrionali, senza ricorrere agli ovociti Cercare di comprendere il meccanismo che nel citoplasma degli ovocitipermette di risvegliare il DNA differenziato e riportarlo allo stato di totipotenza come se fosse una cellula embrionale totipotente

12. cellule staminali pluripotenti indotte, iPS : cellule somatiche adulte riprogrammate alla pluripotenza staminale Cellule iPS murine e umane sono state ottenute da cellule somatiche differenziate adulte, indotte a esprimere combinazioni di geni tipici di stadio staminale, implicati nella promozione o mantenimento della pluripotenza (es.fattori di trascrizione OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, Nanog, Lin28). Cellula somatica umana differenziata Cellule somatiche riprogrammate >staminali Cellula somatica di topo differenziata

13. Fibroblasto, differenziato > fibroblasti Cellula nervosa Cellula ematica Cellula germinale Le cellule, per es. fibroblasti della pelle, vengono riprogrammate e acquistano una pluripotenzialità staminale, con la capacità di generare tutti i tipi di cellule differenziate, sia somatiche sia germinali. Cellule iPS sono state successivamente ottenute da cellule staminali neurali adulte murine e umane, mediante l’espressione del solo fattore OCT4. Fibroblasto riprogrammato

14. Lo sviluppo di cellule iPS rappresenta un significativo avanzamento non solo verso la comprensione della regolazione epigenetica della trascrizione, per riprogrammare il destino cellulare nelle cellule somatiche terminalmente differenziate, ma anche verso la possibilità di generare cellule staminali pluripotenti individualizzate, a partire da cellule somatiche adulte, per trapianti terapeutici in vivo: senza dover ricorrere alle cellule staminali di embrioniottenuti solo allo scopo di ottenere linee staminali dautilizzare per le varie ricerche e terapie a diversi livelli (problemi etici..)

15. zigote Fecondazione in vitrocon spermatozoo Es.di applicazione del trasferimento di nucleo di cellula somatica di donna1in ovocita di donna2, per aggirare il pericolo derivante da mitocondrianomali della donna1 che desidera avere un figlio Mitocondri alterati Mitocondri normali Asportazione del nucleo dell’ovocita di donna2 Inserimento del nucleo diploide di cellula somatica di donna1 Zigote: geneticamente possiede corredo di donna1 , mitocondri di donna2ma con DNA senza influenza sulle caratteristiche dell’individuo

16. Cenni su alcunecaratteristichedell’uovo

17. Uovo : bioreattore capace di riprogrammare geneticamente il genomadi cellule differenziate Animali transgenizzati possono produrre uova contenenti nell’albumemolecole facilmente separabili e utilizzabili in terapie varie:interferone umano, anticorpo monoclonale murino umanizzato controil melanomamaligno.. Possibile iniettare RNA messaggero di coniglio in uova di xenopus (rana) per ottenere emoglobina di coniglio Crioconservazione di spermatozoi e uova per problemi di fecondazione assistita, utilizzazione futura per eventuali fecondazioni in casi disterilità o trattamenti che pregiudicano la fertilità ecc. Ricerche per riottenere la oogenesi in ovari non più ovulanti

18. Le uova presentano grande varietà di dimensioni (struzzo…mammiferi)uova umane circa 200 micrometri Uovo di gallina:citoplasma (tuorlo) suddiviso in citoplasmaformativo + nucleo: polo animale: ricco di mitocondri, ribosomi, RNAmcontribuisce alla formazione dell’embrionenutritivo (vitello, lecite):polo vegetativo: lipidi,proteine:glicogeno:contribuisce al nutrimento dell’embrioneguscio:costituito da proteine, fosfato di calcio, carbonato di calcio e magnesio(albume:barriera protettiva, riserva di proteine,vitamine,H2O)(guscio e albume forniti alla cellula uovo mentre attraversa l’ovidutto) In funzione della quantità e distribuzione del lecite si distiguono uova:telolecitiche (ricche di lecite…monotremi, gasteropodi, uccelli, rettili, anfibi, pesci)oligolecitiche (povere di lecite..placentati, echinodermi)mesolecitiche(poco lecite..anuri) La distribuzione omogenea del citoplasma formativo porta alla formazione dizigoti con blastomeri dotati di tutte le informazioni necessarie per sviluppareun nuovo individuo(se vengono separate):uova regolatricila distribuzione ineguale genera zigoti a mosaico, con blastomeri dotati solodi parte del corredo genetico:uova a mosaico Fonte energetica importante:Ricco di proteine ad elevato potere nutritivo, vitamine, fosfolipidi, mineraliPotere calorico basso 65 calorie/uovo gallina

19. Oogenesi umana: due ovari rivestiti d tonaca albuginea (connettivo) conzona corticale (presenta oociti in vario stadio di maturazione)zona midollare (presenta connettivo e vasi sanguigni) Gli oogoni si moltiplicano per mitosi e si differenziano per meiosi duranteil periodo embrionale e parte di quello fetale:alla nascita sono presentivari tipi maturativi:la meiosi definitiva riprenderà, ciclicamente, allapubertà e continuerà fino alla menopausa ( circa 500 in circa 30 anni) La meiosi comporta una doppia divisione con comparsa di una cellulauovo (gamete) e 3 polociti o globuli polari: se avviene la fecondazionesi forma lo zigote che possiede il corredo cromosomico diploide tipicodella specie (46 cromosomi nell’uomo); se non avviene la fecondazionel’uovo è destinato alla morte. Nella partenogenesi si può ottenere uno zigote, diploide, mediantel’assorbimento da parte dell’uovo, di un globulo polare:può essereaccidentale, facoltativa(api), ciclica(rotiferi)telitoca > solo femmine:afidi, rotiferiarrenotoca > solo maschi:apideuterotoca > maschi e femmine