Outline Lecture 2 Production of Polyclonal Antibodies Production of Monoclonal Antibodies

1. Outline Lecture 2 Production of Polyclonal Antibodies Production of Monoclonal Antibodies

2. Monoclonal Antibodies (โมโนโคลนอลแอนติบอดี้) • - Dr.CesalMilstein และDr. George Kohler ซึ่งเป็นนักวิจัยแห่งมหาวิทยาลัยแคมบริคจ์ ได้ค้นพบโมโนโคลนอลแอนติบอดี และได้รับรางวัลในสาขาการแพทย์ด้านวิทยาภูมิคุ้มกันเมื่อปี 1984 • ในอดีตการเตรียมแอนติบอดีจะได้โพลีโคลนอลแอนติบอดี (Polyclonal antibody) ซึ่งเป็นการยากที่จะให้ได้ antibodies (Ab) หรือ immunoglobulin ที่มีความจำเพาะและมีคุณสมบัติตามที่ต้องการสูง • โดยปกติร่างกายของมนุษย์และสัตว์จะสามารถสร้างAbขึ้นมาได้มากกว่า 2 ล้านชนิด เนื่องจากปริมาณของAbที่ร่างกายสร้างขึ้นมามีมากมายหลายชนิดจึงทำให้Abที่ร่างกายมนุษย์ผลิตขึ้นมามีปริมาณที่ตํ่าและไม่มีความบริสุทธิ์ ดังนั้นความสามารถที่จะทำลายทั้งแบคทีเรียและไวรัสเมื่อมีการติดเชื้อเข้ามาในร่างกายจะตํ่า

3. Polyclonal Antibodies (โพลีโคลนอลแอนติบอดี้) • Polyclonal antibodies แต่ละชนิดจะเป็นกลุ่มของ immunoglobulin (Ig) ที่มีความไม่เหมือนกัน (heterogeneous) เพราะถูกสร้างมาจากเซลล์ หรือ clone ต่างชนิดกันและมีความจำเพาะต่ำ

4. Production of Polyclonal Antibodies

6. Advantages of Polyclonal Antibody • • Multiple clones give high levels of labeling for a single antigen because they contain many antibodies to different epitopes on the same protein. • Disadvantages of Polyclonal Antibody • Shared epitopes on different proteins can label multiple proteins that are not the antigen protein. • Obtaining the antibody depends on a living animal and the ultimate death of the rabbit means no more antibody.

7. Monoclonal Antibodies Milstein และ Kohler  ได้อาศัยหลักการและแนวทางในการทำให้Abที่ต้องการให้บริสุทธิ์และมีความเฉพาะเจาะจงที่จะยึดตัวเองบนแอนติเจน (antigen; Ag) ของแบคทีเรีย หรือไวรัส เพียงชนิดเดียว ซึ่งวิธีการนี้ได้ถูกเรียกว่า Monoclonal Antibodies (MAbs) http://www.youtube.com/watch?v=Gykx5FrQbvU http://www.youtube.com/watch?v=lcHy8THENXo

8. Monoclonal Antibodies (โมโนโคลนอลแอนติบอดี้)

9. ลักษณะสำคัญของ Monoclonal Antibodies • Monoclonalantibodies แต่ละชนิดจะเป็นกลุ่มของimmunoglobulin (Ig) ที่มีความเหมือนกัน (homogeneous) เพราะถูกสร้างมาจากเซลล์ หรือclone ชนิดเดียวกันและมีความจำเพาะสูง • การนำเอาวิธีของMonoclonalAntibodies มาใช้ในการรักษาโรคจะสามารถใช้ระยะเวลาในการรักษาที่สั้น ตรงสาเหตุของโรค ได้ผลที่แน่นอน และรวดเร็ว

11. มี Ab ชนิดเดียว และจับกับEpitope ชนิดเดียวบน Ag นั้น มี Ab หลายชนิด และจับกับEpitope หลายชนิดบน Ag นั้น

12. เปรียบเทียบ polyclonal และ monoclonal antibodies

13. โรคที่ถูกรักษาโดยใช้วิธี monoclonal antibodies - โรคไขข้ออักเสบ โรคเส้นโลหิตตีบ มะเร็งหลาย ๆ ชนิด และการติดเชื้อจากไวรัส - ในปัจจุบันมีAbประมาณ 100ชนิด และอีกจำนวนนึงที่รอการยอมรับเพื่อใช้ในการรักษาโรค - การพัฒนางานด้านนี้ต่อไปของ Dr.Milstein คือความพยายามที่จะทำให้Ab แทรกซึมเข้าสู่ผิวของเซลล์มะเร็ง และรักษาโปรตีนที่ไม่ปรกติภายในเซลล์

14. กรรมวิธีและขั้นตอนในการผลิต Monoclonal Antibodies การเตรียมแอนติเจน (Antigen preparation) การฉีดกระตุ้นในหนู (Immunization) ฆ่าหนูเพื่อนำเอาเซลล์ม้าม (Spleen cells) ของหนูออกมา การรวมเซลล์ (Cell fusion) การคัดเลือกเซลล์ลูกผสม (hybrid cell) หรือ hybridomas การทำ Cell cloning และการเพิ่มปริมาณของ clone (Clonal expansion) 7. การแยกสกัดบริสุทธิ์ของโมโนโคลนอลแอนติบอดี้ (Purification of MAbs)

15. 1. Antigen preparation 2. Immunization 3. Isolation of spleen cells 4. Cell fusion 5. Hybridomas 6. Clonal expansion 7. Purification of MAbs

16. การเตรียมแอนติเจน • Ag ที่ใช้จะต้องมีความบริสุทธิ์มากที่สุด และมีปริมาณพอเพียงที่จะกระตุ้นให้สัตว์ทดลองสร้าง Abสนองต่อ Ag ที่ฉีดเข้าไป • สามารถตรวจสอบ (Characterized) monoclonal antibodies ที่สร้างขึ้นมาว่ามีความจำเพาะต่อส่วนใดของ Ag ตัวอย่างให้เห็นว่ามี 2 antigen sites คือตำแหน่งของ a และ b

17. Methods to Prepare Antigen เตรียมแอนติเจนจากการเพาะเลี้ยงเชื้อไวรัส นำมาทำให้อนุภาคไวรัสแตก (viral lysate) และแยกโปรตีนบริสุทธ์ โดยวิธีปั่นรอบสูงแยกชั้น ในสารละลายที่มีความหนาแน่นแตกต่างกัน (zonal sucrose gradient ultracentrifugation) ข้อดี: แอนติเจนมีลักษณะครบในสภาพธรรมชาติ ข้อเสีย:เตรียมได้ยาก ต้นทุนสูง 2. การพัฒนาการเตรียมแอนติเจนขึ้นใหม่โดยใช้ recombinant protein สามารถเลือกโปรตีนเฉพาะส่วนที่สำคัญ ข้อดี: มีความไวและความจำเพาะมากขึ้น ข้อเสีย:มีปัญหาในแง่ของผลบวกเทียม เนื่องจากอาจมีโปรตีนของแบคทีเรียที่ใช้ในการเตรียมแอนติเจนปนอยู่ 3. แอนติเจนเป็นเปปไทด์สังเคราะห์ โดยเลือกเปปไทด์ที่จำเพาะ เปปไทด์ที่สังเคราะห์นี้มีลักษณะโครงสร้างต่างจากลักษณะในธรรมชาติ อาจทำให้ความไวของการทดสอบลดลง และพบผลลบปลอม

18. Recombinant protein Synthetic peptide

19. การฉีดกระตุ้นสัตว์ทดลอง - Ag ที่ใช้กระตุ้นหนูจะถูกฉีดเข้าทางช่องใต้ผิวหนัง(subcutaneous injection)อาจมีการฉีดซ้ำภายหลังฉีดครั้งแรก 1, 2 หรือ 4 อาทิตย์ (booster) - หนูจะสร้าง Abคือ ANTI-a และ ANTI-b ขึ้นมาตอบสนองต่อ Antigen a และ b ที่ฉีดกระตุ้นเข้าไป

20. สัตว์ทดลอง (Experimental animal) ใช้หนู Mouse สายพันธุ์ Balb/c ซึ่งเป็น Inbred strain ที่สามารถตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อแอนติเจนชนิดต่างๆ ได้ดี 
 Mouse Balb/c Rattusrattus

21. ฆ่าหนูเพื่อนำเอาเซลล์ม้าม • ทดสอบหาระดับของAbที่ต้องการโดยทำการเจาะเลือดจากข้างเป้าตาหรือจากหางของหนู ถ้าระดับไตเตอร์สูงมากจะมีโอกาสได้ clone cell สูง • ก่อนฆ่าหนูเพื่อนำเซลล์ม้ามมาใช้จะต้องมีการกระตุ้น (booster) ก่อน โดยละลาย Ag ในน้ำเกลือแล้วฉีดเข้าเส้นเลือดทางหาง หรือเข้าช่องท้อง3 วันก่อนที่จะฆ่าเอาม้ามหนู

22. ไตเตอร์มีคำจัดกัดความว่า ปริมาณของสารหนึ่งทำปฏิกิริยากับอีกสารหนึ่งที่มีปริมาณคงที่ หรือปริมาณของสารหนึ่งที่พอเหมาะกับอีกสารหนึ่งที่มีปริมาณคงที่ ในทาง Clinical immunology หมายถึง ส่วนกลับของ dilution สุดท้ายของแอนติบอดีย์ (หรือแอนติเจนบางกรณี) ที่ยังให้ผลบวกกับการทดสอบนั้น ๆ สมมุติว่า 1:160 ของซีรั่ม ยังให้ผลบวกกับ Widal test (เกิดการจับกลุ่มของเชื้อ Salmonella typhi) เรียกว่าซีรั่มนั้นมี titer = 160

23. การรวมเซลล์ • ทำการรวมเซลล์จากม้ามหนูกับเซลล์มะเร็ง (Myeloma cell หรือ plasmacytoma cell) เซลล์มะเร็งจะมีคุณสมบัติในการเจริญเติบโตอย่างรวดเร็วเพราะเป็น Immortal B Tumour และขาดเอ็นไซม์ Hypoxanthine Guanine PhosphoribosylTransferase (HPRT หรือ HGPRT) เซลล์มะเร็งที่นำมาใช้เลี้ยงจะต้องไม่มีการปนเปื้อนจากเชื้อราหรือแบคทีเรีย และมีจำนวนของเซลล์ที่มีชีวิต (viable cell) ไม่ต่ำกว่า 90% • Myeloma cell ส่วนใหญ่ใช้ P3-X63-Ag-8.653 สาร polyethylene glycol(PEG)จะถูกนำมาใช้ในการรวมเซลล์ (fusion) จากม้ามหนูกับเซลล์มะเร็ง • ผสมสารละลายเซลล์จากม้ามหนูและสารละลายเซลล์มะเร็ง ในอัตราส่วน spleen cell ต่อ myeloma cell = 5:1 (ซึ่งบางกรณีอาจใช้ถึง 10:1 หรือ 20:1) • นำสารละลายเซลล์ไปเพาะเลี้ยงใน HAT medium

25. การคัดเลือกเซลล์ลูกผสม (hybrid cell) หรือhybridomas • HAT medium ซึ่งเป็นอาหารเฉพาะ (selective medium) ที่ประกอบไปด้วยสารที่ชื่อHypoxanthine, AminopterinและThymidine • อาหาร HAT medium ถูกพบโดย Littlefield เมื่อปี ค.ศ. 1964 และเฉพาะเซลล์ลูกผสม (hybrid cell) หรือ hybridomasเท่านั้นที่สามารถเจริญในสารอาหารนี้ได้ • เซลล์ที่จะรอดชีวิตใน HAT medium จะต้องมีเอ็นไซม์ที่สำคัญสองชนิดคือเอนไซม์ที่ชื่อThymidine Kinase (TK) และเอ็นไซม์Hypoxanthine Guanine PhoepnoribosylTransferase(HPRT หรือ HGPRT)

26. การคัดเลือกเซลล์ลูกผสม (hybrid cell) หรือhybridomas เอ็นไซม์ Thymidine Kinase (TK) และเอ็นไซม์ Hypoxanthine Guanine PhoepnoribosylTransferase (HGPRT) มีความสำคัญต่อการสร้าง DNA การสร้าง DNA จะไม่เกิดขึ้นถ้าเซลล์ขาดเอ็นไซม์ตัวใดตัวหนึ่ง การนำเอาเซลล์มะเร็งที่ไม่มีเอ็นไซม์ HGPRT ไปทำรวมกับเซลล์ปกติจากม้ามของหนูแล้วนำไปเลี้ยงใน HAT medium เซลล์ที่จะรอดชีวิตอยู่ได้ก็คือ hybrids ระหว่างเซลล์มะเร็งและเซลล์ปกติจากม้ามของหนูเท่านั้น

27. De novo DNA Synthesis Pathways Savage pathway Savage pathway Hypoxanthine, AminopterinและThymidine (HAT medium) Substrate Inhibitor Substrate

28. *Immortal B Tumour(Myeloma cells) จะให้คุณสมบัติของเซลล์มะเร็งที่จะเจริญเติบโตได้ดีในการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง* เซลล์ปกติจากม้ามของหนู (Plasma cells) จะให้คุณสมบัติในการสร้างเอ็นไซม์ HGPRT และคุณสมบัติให้การสร้างAb

29. เซลล์ปกติจากม้ามของหนูซึ่งไม่ได้รวมตัวกับ Immortal B Tumour จะตายไปเองตามภายหลังจาก fuse cell ทั้ง 2 ชนิดประมาณ 10-14 วัน ส่วนเซลล์ Immortal B Tumour จะตายเนื่องจากขาดเอ็นไซม์HGPRT • * เซลล์ที่มีชีวิตอยู่ใน HAT medium จะเป็นhybridoma cell เท่านั้น ซึ่งจะแบ่งตัวเป็น colony มองเห็นได้ด้วยตาเปล่าจากนั้นจึงนำไปตรวจหา specificmonoclonal antibody ต่อ Antigen a และ b ที่ต้องการถ้า Colony ไหนให้ผลบวกก็จะย้าย Colony นั้นไปเลี้ยงต่อใน media เพื่อเพิ่มจำนวนให้มากขึ้น

30. TK+ TK+ HGPRT+ TK+ ไม่สามารถมีชีวิตอยู่นอกร่างกาย ไม่มี HGPRT

31. การทำ Cell cloning และการเพิ่มปริมาณของ clone • การทำ Cell cloning เมื่อได้ colony ที่สร้าง monoclonal antibodies ที่ต้องการแล้ว อาจมีการปนเปื้อนของ colony อื่น ที่ไม่ได้สร้าง Abติดมา ดังนั้นจำเป็นต้องคัดเลือกเอาเฉพาะ colony ที่ต้องการเท่านั้นโดยใช้วิธี • Limiting Dilution Technique ซึ่งทำโดยการเจือจางเซลล์ให้มีความเข้มข้นที่ต้องการแล้วเพาะเลี้ยงลงใน tissue culture plate ชนิด 96 หลุม โดยให้ความเข้มข้นของเซลล์แต่ละหลุมมีปริมาณ 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 และ 0.25 cell ต่อหลุม ตามลำดับ • ทำการเพาะเลี้ยงประมาณ 10-15 วัน เลือก colony ที่เกิดขึ้นในหลุม ที่ระดับความเข้มข้น 1 cell/well และให้ผลบวกในการสาร Ab • เก็บเอา colony นั้นมาทำการเพาะเลี้ยงและเพิ่มจำนวนเซลล์ต่อไป

32. Freeze in Liquid Nitrogen Tank and stored at -70C freezer. For further use, dissolve hybridomas with nutrient media and culture them on flasks and allow them to grow.

33. Purification of Monoclonal Antibodies Small-Molecule-Based Affinity Chromatography Method for Antibody Purification

34. Take Home Message Polyclonal vs Monoclonal Antibodies Steps in producing MAbs HAT selection