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La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de febrero de 2009. La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN). Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe. HPN Definición.

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La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

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  1. III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de febrero de 2009 La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe

  2. HPNDefinición • Enfermedad clonal adquirida de la célula hematopoyética pluripotencial • Mutación somática en el gen PIG-A (fosfatidil-inositol-glucano de clase A) implicado en la síntesis de glucosilfosfatidilinositol (GPI) • Carencia total o parcial de la expresión de proteínas ancladas a la membrana a través del componente GPI en parte de la células hematopoyéticas

  3. HPNAlteración genética: Gen PIG-A Bloqueo en la HPN • Uno de los más de 20 genes implicados en la síntesis de las proteínas ancladas a GPI • Se encuentran mutaciones del gen PIG-A en todos los casos en que se ha interrumpido la síntesis de GPI • Como consecuencia de la mutación se reduce o falta la expresión de proteínas ancladas a la superficie de la célula por moléculas de GPI PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  4. HPNProteínas ancladas a GPI • Enzimas: acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina granulocítica • Moléculas de adhesión: CD48, CD58, CD66b-c • Proteínas reguladoras del complemento: • CD55: factor que acelera la degradación de las convertasas del complemento (DAF) • CD59: inhibidor de membrana de la lisis reactiva (MIRL) • Receptores: CD14, CD16, CD87, CD90 • Antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios • Antígenos del neutrófilo • Otros: CD24, CD52 Hernández-Campo et al. Med Clin. 2008; 131: 617-630

  5. Distribución de las proteínas ancladas a GPI CD55 CD58 CD59 PrPC AChE JMH Ag Dombroch HG Ag Células B CD24CD55 CD58CD59 CD48 PrPC CD73 CD108 Células progenitoras hematopoyéticas Hematíes CD55 CD58* CD59 CD48 CD52 CD87 CD108 PrPc ADP-RT CD73 CD90 CD109 CD16* Células T CD55 CD58 CD59 CD109 PrPC GP500 Gova/b Plaquetas CD59, CD90, CD109 Células NK CD55 CD58* CD59 CD14 CD16 CD24 CD48 CD66b CD66c CD87 CD109 CD157 LAPNB1 PrPC p50-80 GPI-80 ADP-RT NA1/NA2 Monocitos CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 PrPc CD16 (Cortesía de Lucio Luzzatto) PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK PMN CD14 CD55 CD58* CD59 CD48 CD52 CD87 CD109 CD157 Grupo 8 PrPC GPI-80 CD16

  6. Déficit de proteínas GPI: hemólisis intravascular • La reducción o ausencia de CD55 y CD59 en la superficie de los eritrocitos los hace muy vulnerables a la acción del complemento y provoca su destrucción • CD55 (DAF): previene la formación de complejos C3-C5-convertasa esenciales para la amplificación de la secuencia de activación de las proteínas del sistema de complemento • CD59 (MIRL): inhibe la formación del complejo de proteínas del sistema del complemento C5b-C9 de ataque de membrana • Déficit de CD59: formación de poros en la membrana y muerte celular

  7. CD59 CD59 Complejo de ataque a la membrana HPNCascada del Complemento Vía alternativa Vía clásica CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  8. HPNTipos de hematíes según sensibilidad al complemento • HPN tipo I: sensibilidad normal a la acción del complemento • HPN tipo II: sensibilidad intermedia (3-5 veces superior a la normal). Déficit parcial de CD59 • HPN tipo III: sensibilidad elevada (15-25 veces superior a la normal). Déficit total de CD59 Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 736-748 Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 749-757

  9. HPNIncidencia y prevalencia • Enfermedad rara, pero grave • Incidencia: 1,3 casos por 1.000.000 habitantes y año • Prevalencia: 7-16 casos por 1.000.000 habitantes • Afecta igual a hombres y mujeres Hill A et al. Blood 2006; 108: A985

  10. HPNHistoria Natural

  11. HPNHistoria Natural • Amplio espectro de manifestaciones clínicas • Mediana de edad al diagnóstico  40 años • Mortalidad atribuible  50% (trombosis y citopenias) • La trombosis es la principal causa de mortalidad y de morbilidad • Mediana de supervivencia: 10-25 años • Remisión espontánea: 15%

  12. HPN Clínica Anemia aplásica Trombosis Hemoglobinuria • Hemólisis intravascular– síntomas 1 • dolor abdominal • disfagia • disfunción eréctil • letargia • Trombosis2,3 • - hepática, cerebral •  50% • de pacientes • Insuficiencia medular • puede preceder a la HPN4,5 1. Rother et al. JAMA 2005;293:1653-627. 2. Hillmen P, Lewis SM, Bessler M et al. N Engl J Med 1995;333:1253-8. 3. Socie G, Mary JY, Gramont A et al. Lancet 1996;348:573-7. 4. Wang et al. Blood 2002;100:3897–902. 5. Dunn et al. Ann Int Med 1999;131:401–8.

  13. HPNClasificación • HPN clásica: hemólisis intravascular, % elevado de granulocitos deficientes en proteínas GPI y una población mayoritaria de hematíes tipo III. Sin otra enfermedad medular asociada • HPN asociada a otras hemopatías: hemólisis intravascular en el contexto de otra enfermedad medular como AA y SMD • HPN subclínica: sin evidencia clínica ni analítica de hemólisis. Mediante citometría de flujo se detectan pequeños clones de células de HPN. Asociación frecuente con insuficiencia medular (AA y SMD) Parker C et al. Blood 2005;106:3699-709

  14. ¿HPN sintomática o molecular? • Mosaicismo: células progenitoras normales y patológicas • Enfermos con pequeños clones raramente tendrán síntomas relacionados con la HPN • En pacientes con clones de granulocitos HPN < 10% la clínica de hemólisis será mínima o nula (AA y anemia refractaria) • Un clon de granulocitos HPN superior a 50%: mayor riesgo de trombosis • El tamaño del clon puede variar con el tiempo y un 15% de enfermos con HPN hemolítica pueden tener remisión espontánea • El tratamiento va a depender, en gran medida, de la presentación clínica y del tamaño del clon HPN

  15. HPNTratamiento • Sintomático (transfusiones, anticoagulación oral, corticoides, ácido fólico, hierro,…) • Trasplante de progenitores hematopoyéticos: único tratamiento curativo • Eculizumab (anti-C5): nuevo tratamiento específico de la HPN (Registro Internacional de HPN)

  16. Eculizumab: Anticuerpo anti-C5 Human framework regions CH1 Hinge CL Complementarity determining regions(murine origin) CH2 Human IgG4 heavy chain constant regions 2 and 3 Human IgG2 heavy chain constant region 1 and hinge CH3 Rother et al. Nature Biotech 2007;25:1265–73

  17. Eculizumab CD59 CD59 Complejo de ataque a la membrana HPNCascada del Complemento Vía alternativa Vía clásica CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  18. HPN¿Quién debería ser estudiado? • Hemoglobinuria • Hemólisis intravascular no inmune (Coombs negativo, LDH elevada) especialmente si ferropenia • Trombosis de localización infrecuente: síndrome de Budd-Chiari, venas abdominales, cerebrales o dérmicas • Anemia aplásica • SMD: Anemia refractaria • Disfagia o dolor abdominal y hemólisis intravascular • Citopenias mantenidas de origen desconocido Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

  19. HPNEvaluación inicial • Estimar el grado de hemólisis: hemograma, reticulocitos, LDH sérica, bilirrubina fraccionada y haptoglobina • Determinar el grado de insuficiencia medular: aspirado y biopsia de médula ósea y citogenética • Establecer el déficit de proteínas asociadas a GPI: detección de poblaciones de células de sangre periférica (hematíes, neutrófilos y monocitos) deficientes en antígenos asociados a grupos GPI Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

  20. HPNMétodos Diagnósticos • Pruebas clásicas: aumento de la sensibilidad de los hematíes a la lisis mediada por el complemento • Citometría de flujo (CMF): ausencia de proteínas asociadas a grupos GPI • Análisis molecular: secuenciación e identificación de mutaciones del gen PIG-A

  21. HPNPruebas Clásicas Pruebas de Ham-Dacie y de sacarosa • Técnicas laboriosas • Difícil estandarización • Restringidas a hematíes • Falsos negativos (especialmente en pacientes transfundidos) • Requiere un 5% de células tipo III (déficit total) o un 20% de tipo II (déficit parcial) para dar resultados positivos • Interés histórico

  22. Suero fresco acidificado inactivado por calor Suero fresco acidificado + magnesio Suero fresco Suero fresco acidificado Salino + hematíes Control de sacarosa Sacarosa PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  23. HPNAnálisis Molecular • Secuenciación del gen PIG-A • No aplicable como técnica de rutina • Laboratorios de investigación

  24. HPNCitometría de Flujo • Nicholson-Weller, 1985: aplicación de la CMF al diagnóstico de la HPN • Van der Schoot, 1990: superioridad de la CMF sobre la prueba de Ham • Hall & Rose, 1996: CMF como método de elección • Brodsky, 1999, 2000: método diagnóstico alternativo, proaerolisina conjugada con fluoresceína (FLAER, de fluorescein-labelled AERolysin) Vidriales M. B. Haematologica (ed. esp.) 2008; 93 (Supl.2); 9-11

  25. Citometría de FlujoVentajas • Rapidez (1 hora) • Sensibilidad (clones <1%) • Marcaje múltiparamétrico: con tres anticuerpos la sensibilidad puede llegar a 0,01% • Análisis de diferentes líneas celulares • Detección de clones de hematíes tipo I/II/III • Cuantificación y monitorización del tamaño del clon HPN

  26. HPNCitometría de Flujo • El análisis por citometría de flujo es el método de elección para el diagnóstico y seguimiento de la HPN

  27. Citometría de FlujoCélulas Analizar un mínimo de dos líneas celulares: • Hematíes • Neutrófilos y monocitos • Linfocitos: discrepancias en el tamaño clonal respecto a los neutrófilos • Plaquetas: expresión débil y variable de proteínas GPI en controles sanos

  28. Citometría de Flujo Tamaño del clon HPN • Tamaño del clon de hematíes - Tipos de hematíes: I/II/III - Proporción de hematíes HPN en relación a la última transfusión • Tamaño del clon de neutrófilos: refleja mejor el tamaño del clon HPN • Tamaño del clon de monocitos: valida el tamaño del clon HPN (puede tener discrepancias con los neutrófilos)

  29. Citometría de FlujoEstudio de hematíes • Análisis multiparamétrico con marcaje directo • Adquisición con SSC/FSC en escala logarítmica • Estudio de dos antígenos GPI diferentes: CD55 y CD59 (permite descartar deficiencias congénitas aisladas) • Incluir un AcMo frente a un antígeno eritroide no asociado a GPI para seleccionar los hematíes (CD235a) • CD59: discrimina hematíes tipo I, II y III • Las transfusiones afectan el tamaño del clon de hematíes (realizar estudio tras un mínimo de un mes desde la última transfusión) • El estudio puede realizarse hasta 2 semanas tras la extracción de la muestra (mantener los hematíes a 4º C) • Incubación mínima de 15 min y un solo lavado • Incluir un control de sangre normal

  30. Hematíes: análisis multiparamétrico Combinación CD59 FITC/CD55PE/CD235a PE-Cy5 Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  31. CD59: Identificación y cuantificación de clones HPN PNH Count CD59 FITC-A Tipo I: células con expresión normal de CD59 Tipo II: células con deficiencia parcial de CD59 Tipo III: células con deficiencia completa de CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  32. HPN clásica: hematíes Control Control HPN clásica Tipo III HPN clásica Tipo II Tipo I

  33. HPN CD59: hematíes <1% HPN subclínica HPN AA 12,2% Tipo II 84% Control HPN clásica Tipo I Tipo III

  34. Citometría de FlujoEstudio de leucocitos • El análisis en granulocitos es superior al de hematíes para establecer el tamaño del clon HPN • El estudio debe ser multiparamétrico lo que permite detectar de forma simultánea la deficiencia de antígenos GPI e identificar clones de HPN de pequeño tamaño • Es muy importante la selección de los AcMo contra antígenos GPI (alta expresión en células normales, específicos de una línea celular, baja afinidad por uniones inespecíficas y combinables en un marcaje múltiple) • Es recomendable utilizar AcMo no asociados a GPI para seleccionar la población diana • La técnica de FLAER permite detectar pequeños clones HPN

  35. Citometría de FlujoNeutrófilos y monocitos • Sangre periférica en EDTA (<24 horas) • Análisis multiparamétrico con marcaje directo • Neutrófilos: CD16, CD24, CD55, CD59 y CD66b • Monocitos: CD14, CD52, CD55, CD59 • Selección de la población: CD15, CD33 • Se debe valorar la presencia de formas inmaduras y displasia (citología/CMF). • Adquisición de 100.000 eventos • Incluir un control normal de forma paralela • CD55 y CD59: lisar y marcar • Análisis inicial de neutrófilos y monocitos (CD16/CD14), si compatible con HPN analizar hematíes

  36. Estrategia de análisis: neutrófilos y monocitos P1+P3 = granulocitos P2+P4 = monocitos Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  37. Neutrófilos: CD16 Control HPN Subclínica HPN Clásica

  38. Neutrófilos: CD55 HPN AA 3,5% Control HPN clásica: 92%

  39. Neutrófilos: CD55 HPN subclínica: 1,2% HPN AA: 6,5% HPN clásica: 92% Control

  40. Monocitos: CD14 HPN AA: 7% Control HPN clásica: 93%

  41. Monocitos: CD55 HPN AA: 6% HPN clásica: 93% Control

  42. Citometría de FlujoFLAER • La aerolisina es una toxina secretada por la Aeromonas hydrophila, que produce hemólisis mediante la unión a la molécula GPI • La proaerosilina es una variante inactiva de la proteína bacteriana que está conjugada con fluoresceína (FLAER) y que mantiene la capacidad de unión a GPI sin causar lisis • Restringida a leucocitos, permite la identificación y cuantificación de pequeños clones de HPN (<0,02%) • Puede utilizarse sola o en combinación con más anticuerpos dirigidos frente antígenos GPI • Permite el análisis de pacientes con SMD Brodsky RA, et al. Blood 1999; 93: 1749-1756. Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

  43. FLAER Alexa 488 Citometría de Flujo FLAER Células normales Células normales Células HPN Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

  44. FLAER: análisis de los clones HPN HPN Clon de granulocitos HPN = 8,9% Clon de monocitos HPN = 8,1% FLAER/ CD24 /CD16 /CD33/CD15/CD14 Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  45. HPNCMF: Seguimiento • El seguimiento y la monitorización del clon de HPN es esencial en el manejo clínico del enfermo • En los enfermos en tratamiento con eculizumab aumenta el clon de hematíes y se iguala al de neutrófilos en unos 6 meses de media • Monitorizar el clon de granulocítos es importante por el riesgo de trombosis • En HPN subclínica se recomienda controlar el tamaño del clon tras iniciar tratamiento con inmunosupresores • El tamaño del clon puede variar con el tiempo y pacientes con un clon de HPN estable y de tamaño intermedio peden tener una remisión espontánea Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

  46. Citometría de Flujo Seguimiento del clon HPN Controles mínimos (Registro Internacional de HPN): • Pacientes con HPN clásica sin eculizumab y en HPN asociada o subclínica: anual • Enfermos con HPN con eculizumab: al inicio del tratamiento, a los 6 meses y después anual • Reevaluación si cambios clínicos Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

  47. SeguimientoClon de hematíes con eculizumab HPN clásica: 60% diagnóstico Células control HPN clásica: 95% 1 año con eculizumab

  48. SeguimientoClon de neutrófilos con eculizumab HPN clásica: 94%, diagnóstico Células control HPN clásica: 98%, 1 año con eculizumab

  49. HPN CMF: Temas pendientes • El Registro Internacional de HPN requiere que los datos aportados sean lo más homogéneos posible • El uso de diferentes técnicas complica la estandarización de los resultados • No se dispone de criterios inmunofenotípicos validados para el diagnóstico de HPN • Falta de consenso en la estrategia de análisis y en la selección de los anticuerpos • Necesidad de reuniones de consenso

  50. Citometría de FlujoReunión de Consenso • Objetivo principal: intentar llegar a un consenso en los puntos esenciales del diagnóstico de HPN por CMF, para tratar de disminuir, en lo posible, las diferencias técnicas e intentar homogeneizar los resultados entre distintos laboratorios Madrid, 27 de enero 2009

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