Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe

1. Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe

2. Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka szczepionek • Ściśle zdefiniowany skład • Bezpieczeństwo produkcji • wyeliminowanie konieczności hodowli mikroorganizmów chorobotwórczych w celu izolacji antygenów szczepionkowych • mikroorganizmy stosowane do produkcji antygenów rekombinantowych o statusie GRAS (Generally Recognized as Safe) • Bezpieczeństwo stosowania • brak możliwości wywołania choroby • niska odczynowość • Wymagają stosowania adiuwantów • Koszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu produkcji

3. Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych • Bakterie • dobrze scharakteryzowane • łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych • wydajne systemy ekspresyjne • brak modyfikacji posttranslacyjnych • możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych • możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające rozpuszczalność, zwiększające immunogenność

4. Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych • Drożdże • dobrze scharakteryzowane • łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych • wydajne systemy ekspresyjne • trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z genomem gospodarza • modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków disiarczkowych, glikozylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych • możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające immunogenność

5. Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych • Komórki owadzie • systemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub bakulowirusie • modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż w komórkach ssaczych • wrażliwe na zakażenia wirusowe • Komórki ssacze • modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja, fosforylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych, tworzenie mostków disiarczkowych • droga hodowla • stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do otrzymania

6. Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych • Rośliny transgeniczne • manipulacje genetyczne trudne do przeprowadzenia • tania produkcja • modyfikacje posttranslacyjne • szczepienie drogą pokarmową • wywołanie odporności błon śluzowych

7. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Czynnik etiologiczny – wirus HBV • Rodzina: Hepadnaviridae • Rodzaj: Orthohepadnavirus • Struktura: ikosaedralny nukleokapsyd otoczony podwójną osłonką; kulisty; śr. 42 nm • Kwas nukleinowy: DNA • Replikacja: hepatocyty • Rezerwuar: człowiek

8. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B • Droga przenoszenia: krew i płyny ustrojowe, w tym wydzielina szyjki macicy, nasienie • Wysoka zakaźność – nawet 0,1 μl krwi może spowodować zakażenie • Hodowla w warunkach laboratoryjnych – nie zakaża zarodków kurzych i powszechnie stosowanych linii komórkowych We krwi do 1010 wirusów/ml

9. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu B • Okres wylęgania 2 – 3 miesiące • Początkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączka • Żółtaczka Wyzdrowienie (90%) Przewlekłe zakażenie (10%) Nadostre zapalenie wątroby (0,1%) Przetrwałe zapalenie wątroby niewielkie uszkodzenie wątroby Aktywne zapalenie wątroby Antygenemia brak uszkodzenia wątroby Marskość wątroby Pierwotny rak wątroby Zgon

10. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Wirusowe zapalenie wątroby typu B zakażenie okołoporodowe • Dzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw B • zakażenie z ostrymi objawami choroby • Dzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw B • zakażenie bez ostrych objawów choroby • nosicielstwo HBV • śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców, 15% dziewczynek) Na świecie 200 mln nosicieli HBV z tego 75% ulega zakażeniu podczas porodu

11. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Antygeny wirusa HBV • HBcAg – białko rdzenia • HBeAg – białko rdzenia • HBsAg – białko powierzchniowe • tworzy zewnętrzną osłonkę wirusa • nadmiar białka obecny we krwi w postaci kulistych lub pałeczkowatych agregatów

12. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B • Gen kodujący antygen HBsAg – koduje 3 polipeptydy • preS1 • preS2 • S

13. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Odpowiedź immunologiczna na zakażenie HBV • Odpowiedź humoralna • przeciwciała anty-HBsAg (preS1, preS2 i S) • przeciwciała anty-HBcAg • przeciwciała anty-HBeAg • Odpowiedź komórkowa • limfocyty Tc

14. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki I generacji (plazmatyczne) • Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBsAg • białko S • śladowe ilości białka preS1 • śladowe ilości białka preS2 • Sposób otrzymywania – izolacja ciał kulistych i pałeczkowatych z krwi bezobjawowych nosicieli HBV, inaktywacja formaldehydem • Bezpieczeństwo – ryzyko transmisji patogenów przenoszonych przez krew Nie są stosowane w Polsce

15. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Pierwsza szczepionka zarejestrowana w 1986 r. • Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBsAg • białko S • Sposób otrzymywania – produkcja białka S w komórkach drożdży S. cerevisiae

16. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Pierwszy układ ekspresyjny opublikowany w 1982 r. (P. Valenzuela, A. Medina, W.J. Rutter, Nature, 289, 347 – 350) • wektor ekspresyjny – pHBS-16 • autonomiczna replikacja • ori replikacji pBR322 • gen oporności na ampicylinę • ori replikacji plamidu 2μ • gen trp1 • sekwencja kodująca białko S pod kontrolą promotora ADH I dehydrogenazy alkoholowej I

17. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) • gospodarz – S. cerevisiae XV610-8C • szczep auksotroficzny – brak zdolności do wzrostu na podłożu nie zawierającym tryptofanu • białko S produkowane w postaci kulistych agregatów (agregaty 1000x bardziej immunogenne niż pojedyncze cząsteczki białka S) • 2 – 5 μg białka z 200 ml hodowli

18. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) • Adiuwant – wodorotlenek glinu • Postać szczepionki – płynna • Temperatura przechowywania – 2-8°C • Sposób podawania – domięśniowo • Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6 tyg.; 3 – po 6 m-cach od pierwszego szczepienia) • Skuteczność szczepionki • u 95% szczepionych ochronny poziom przeciwciał po 3 dawkach • u 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniem • 95% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed zakażeniem • 98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed zakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzenia • indukuje powstanie trwałej pamięci immunologicznej

19. Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał w cyklu szczepień przeciwko WZW typu B

20. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) • Bezpieczeństwo szczepionki – wysokie • może być stosowana u kobiet ciężarnych • matek karmiących piersią • osób z niedoborami odporności • Niepożądane odczyny poszczepienne • łagodne miejscowe odczyny poszczepienne • rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych, wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony układu nerwowego • Przeciwwskazania do szczepień • nadwrażliwość na składniki szczepionki • ciężkie choroby przebiegające z wysoką gorączką

21. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) • Skuteczne w szczepieniu poekspozycyjnym – uodpornienie czynno-bierne (4 dawki – 0, 1, 2, 12 m-cy; HBIg równocześnie z pierwszą dawką szczepionki) • Dostępne w postaci szczepionek monowalentnych • Engerix B, GlaxoSmithKline • H-B-VAX, Merck Sharp Dohme • Dostępne w postaci szczepionek skojarzonych • Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib, WZW B) • Ambirix, GlaxoSmithKline (WZW A, WZW B) • Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)

22. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) • Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Hansenula polymorpha (Hepavax Gene, Green Cross Vaccine, Korea) • Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Pichia pastoris

23. Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki III generacji (rekombinowane) • Białka S i preS2 produkowane w linii komórkowej CHO (Chinese Hamster Ovary cells), Heprecombe, Swiss Serum and Vaccine Institute

24. Saccharomyces cerevisiae • Niski poziom produkcji i sekrecji białek • Niestabilność plazmidów rekombinantowych • Hiperglikozylacja białek • Wąski zakres metabolizowanych źródeł węgla

25. Pichia pastoris i Hansenula polymorpha-podstawowa charakterystyka biochemiczna

26. Metabolizm metanolu 1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 - dehydrogenaza formaldehydowa,5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo- 1,6-bisfosforanu

27. Drożdżowe systemy ekspresyjne • Szczepy gospodarzy ekspresyjnych • Wektory ekspresyjne • bakteryjne ori replikacji • bakteryjny marker selekcyjny • sekwencja umożliwiająca utrzymanie się wektora w komórce drożdży • drożdżowy marker selekcyjny • drożdżowy promotor i terminator transkrypcji AmpR PTEF1 Drożdżowy wektor ekspresyjny PHO5t ColE1 ori 25S rDNA URA3

28. Szczepy ekspresyjne Pichia pastoris

29. Szczepy ekspresyjne Hansenula polymorpha

30. Promotory transkrypcji P. pastoris

31. Promotory transkrypcji H. polymorpha

32. Drożdżowe markery selekcyjne P. pastoris • geny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynę • markery auksotroficzne • gen HIS4 P. pastoris lub S. cerevisiae • gen ARG4 S. cerevisiae • gen URA3 P. pastoris • gen ADE1 P. pastoris

33. Drożdżowe markery selekcyjne H. polymorpha • geny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynę • gen oporności na fleomycynę • markery auksotroficzne • gen LEU 1.1 H. polymorpha • gen URA3 H. polymorpha • gen ADE11 H. polymorpha • gen LEU2 S. cerevisiae • gen URA3 S. cerevisiae • gen LEU2 C. albicans

34. Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży P. pastoris • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną z genomem drożdży • 5’ fragment promotora AOX1 • 5’ fragment promotora GAP • gen HIS4 P. pastoris

35. Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży H. polymorpha • Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży • gen MOX H. polymorpha • gen AMO H. polymorpha • gen LEU2 S. cerevisiae • gen URA3 S. cerevisiae • Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży • sekwencje ARS H. polymorpha

36. Zewnątrzkomórkowa produkcja białek • Sekwencje sygnalne • obcego białka • α-faktora S. cerevisiae • kwaśnej fosfatazy

37. Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez komórki drożdży Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych genów kodujących białka opiekuńcze obecne w retikulum endoplazmatycznym • Foldazy • izomerazy disulfidowe • Białka opiekuńcze • kalneksyna • kalretikulina

38. Kierowanie białek do peroksysomów Peroksysomy • Zdolne do akumulacji dużej ilości białek • Nie zawierają enzymów modyfikujących białka • fosfokinaz • glikozylaz • proteaz Umożliwiają produkcję niezmodyfikowanych białek Sekwencja kierująca do peroksysomów -Ser-Lys-Leu-COOH peroksysomy H. polymorpha rosnąca w pożywce z metanolem

39. Szczepionki przeciwko wirusowi HPV (wirusowi ludzkiego brodawczaka) • Silgard (MSD) Substancja czynna – białko L1 czterech typów HPV (16, 18, 6 i 11) Adiuwant – sole glinu • Cervarix (GlaxoSmithCline) Substancja czynna – białko L1 dwóch typów HPV (16 i 18) Adiuwant – sole glinu + MPL (monofosforylowany lipid A) Białko L1 produkowane w drożdżach S. cerevisiae