GIEMSA I CROMOSOMI POSSONO ESSERE ORDINATI PER DIMENSIONE, POSIZIONE DEL CENTROMERO, PRESENZA DI MARCATORI MORFOLOGICI

1. COLORAZIONE STANDARD • GIEMSA • I CROMOSOMI POSSONO ESSERE ORDINATI PER DIMENSIONE, POSIZIONE DEL CENTROMERO, PRESENZA DI MARCATORI MORFOLOGICI

2. NOMENCLATURA DEI BANDEGGI • CODICE A TRE LETTERE • PRIMA LETTERA • PATERN DI BANDEGGIO • SECONDA LETTERA • AGENTE BANDEGGIANTE • TERZA LETTERA • SOSTANZA COLORANTE ESEMPI: QFQ = QFluorochrome Quinacrine GTG = GTripsin Giemsa GHG = GHeat Giemsa RBG = RBrdU Giemsa RHG = RHeat Giemsa RBA = RBrdU Acridine CBG = CBarium Giemsa

3. BANDEGGI MORFOLOGICI • BANDEGGGIO Q (QFQ) (CASPERSSON, 1970) • SI OTTIENE CON MOSTARDA DI QUINACRINA, FLUOROCROMO AFFINE ALLE BASI A-T • CARIOTIPI DI ROUTINE • STUDIO DELLA REGIONE ETEROCROMATICA DEL CROMOSOMA Y • STUDIO DI VARIANTI POLIMORFICHE

4. BANDEGGIO G (GTG, GHG) • SI OTTIENE MEDIANTE DIGESTIONE ENZIMATICA (TRIPSINA) O DEGRADAZIONE TERMICA (40-50°C) DELLA CROMATINA • PATTERN SOVRAPPONIBILE AL BANDEGGIO Q • MAGGIORE DEFINIZIONE • CARIOTIPI DI ROUTINE • BANDEGGI AD ALTA RISOLUZIONE

5. BANDEGGIO R (Reverse) (RHG, RFG) • SI OTTIENE MEDIANTE DEGRADAZIONE TERMICA (87°C) DELLA CROMATINA O CON FLUOROCROMI AFFINI ALLE BASI G-C (ARANCIO DI ACRIDINA, HOECHST 33258) • PATTERN OPPOSTO AI BANDEGGI Q/G • CARIOTIPI DI ROUTINE

6. BANDEGGIO C (CBG) • SI OTTIENE MEDIANTE DENATURAZIONE DEL DNA CON BASI FORTI (BaOH) ED ALTE TEMPERATURE. SI COLORANO SOLO LE REGIONI DI ETEROCROMATINA COSTITUTIVA (CENTROMERI, COSTRIZIONI SECONDARIE, ETEROCROMATINA DELL'Y), RESTA L'OMBRA DEL CORPO DEL CROMOSOMA • RICERCA DI POLIMORFISMI CROMOSOMICI • STUDIO DELLA REGIONE ETEROCROMATICA DEL CROMOSOMA Y • CARATTERIZZAZIONE DI CELLULE TUMORALI • IDENTIFICAZIONE DI REGIONI AMPLIFICATE

7. BANDEGGI DINAMICIOBANDEGGI REPLICATIVI SI OTTENGONO MEDIANTE INCORPORAZIONE IN COLTURA DI 5-Bromo 2-desossi-Uridina (BrdU) DURANTE FRAZIONI DELLA FASE S

8. LE REGIONI CHE HANNO INCORPORATO BrdU SONO VISUALIZZABILI CON PARTICOLARI COLORAZIONI • BrdU SPEGNE LA FLUORESCNZA DI DIVERSI FLUOROCROMI: ARANCIO DI ACRIDINA, HOECHST 33258 • BrdU INDUCE FOTOLISI PREFERENZIALE DOPO COLORAZIONE CON FLUOROCROMI ED ESPOSIZIONE A LUCE UV (COLORAZIONE FPG) • LE ZONE CHE HANNO INCORPORATO BrdU APPAIONO POCO FLUORESCENTI O PALLIDE • I BANDEGGI DINAMICI PERMETTONO DI COSTRUIRE MAPPE REPLICATIVE DEI CROMOSOMI

9. MODULANDO I TEMPI DI TRATTAMENTO CON BrdU SI OTTENGONO BANDEGGI CON PATTERN SOVRAPPONIBILE A QUELLO DEI BANDEGGI MORFOLOGICI FASE S INIZIALE BANDE G FASE S TERMINALE BANDE R FASE S FINALE BANDE T N.B.B.: X INATTIVO + BrdU = COLORAZIONE PALLIDA = BANDA NEGATIVA - BrdU = COLORAZIONE INTENSA = BANDA POSITIVA

10. BrdU NELLA FASE S INIZIALE • INCORPORANO LE REGIONI A REPLICAZIONE PRECOCE CHE RISULTANO PALLIDE ALLA COLORAZIONE SUCCESSIVA • SI OSSERVA UN BANDEGGIO SOVRAPPONIBILE A QUELLO G MORFOLOGICO QUINDI LE BANDE R (G NEGATIVE) SONO A REPLICAZIONE PRECOCE • BrdU NELLA FASE S TERMINALE • INCORPORANO LE REGIONI A REPLICAZIONE TARDIVA CHE RISULTANO PALLIDE ALLA COLORAZIONE SUCCESSIVA • SI OSSERVA UN BANDEGGIO SOVRAPPONIBILE A QUELLO R MORFOLOGICO, QUINDI LE BANDE G (R NEGATIVE) SONO A REPLICAZIONE TARDIVA

11. BANDA G/Q RICCO IN A-T > CONDENSAZIONE < CONCENTRAZIONE DI GENI A REPLICAZIONE TARDIVA

12. BANDA R RICCO IN G-C < CONDENSAZIONE > CONCENTRAZIONE DI GENI A REPLICAZIONE PRECOCE

13. BANDEGGIO RBG G2 3h • ESPOSIZIONE DELLE CELLULE A BrdU PER LE ULTIME 7 ORE PRIMA DELL'ALLESTIMENTO DEL PREPARATO • LE ZONE A REPLICAZIONE TARDIVA (CONDENSATE, RICCHE IN A-T, G POSITIVE) SARANNO CHIARE, NE RISULTA UN BANDEGGIO R M 1.5h S 9h BrdU 7h G1 10.5 h 24 h

14. BANDEGGIO GBG G2 3h • ESPOSIZIONE DELLE CELLULE A BrdU PER TUTTO IL PERIODO DI COLTURA, LAVAGGIO E SOSTITUZIONE DI BrdU CON TIMIDINA 7 ORE PRIMA DELL'ALLESTIMENTO DEL PREPARATO • LE ZONE A REPLICAZIONE PRECOCE (DECONDENSATE, RICCHE IN G-C, G NEGATIVE) SARANNO CHIARE, NE RISULTA UN BANDEGGIO G M 1.5h Timidina 7h S 9h BrdU 17h G1 10.5 h 24 h

15. COLORAZIONE FPG Fluorochrome Photolysis Giemsa A DIFFERENZA DELLA COLORAZIONE CON ARANCIO DI ACRIDINA E' UNA COLORAZIONE PERMANENTE • COLORAZIONE CON HOECHST 33258 (bis-benzimide) • LA FLUORESCENZA VIENE SMORZATA DOVE E' STATA INCORPORATA BrdU • ESPOSIZIONE DEI VETRINI A LUCE UV. LA LAMPADA PRODUCE CALORE • FOTOLISI PREFERENZIALE DELLE ZONE CON BrdU LEGATA AL FLUOROCROMO SOMMATA A DEGRADAZIONE TERMICA • COLORAZIONE CON GIEMSA: • RISULTANO PALLIDE LE REGIONI CHE HANNO INCORPORATO BrdU • SI COLORANO PIU' INTENSAMENTE LE REGIONI CHE NON HANNO INCORPORATO

16. SCE • ESPONENDO LE CELLULE A BrdU PER DUE CICLI COMPLETI (2 fasi S) SI OTTIENE LA COLORAZIONE DIFFERENZIALE DEI CROMATIDI FRATELLI (SISTER CHROMATIDS DIFFERENTIATION, SCD) • SI DIMOSTRA L'ESISTENZA DI SCE (SISTER CHROMATIDS EXCHANGES) • SI PENSA CHE GLI SCAMBI FRA CROMATIDI FRATELLI SIANO DOVUTI A STRESS ROTAZIONALE ALLA FORCA REPLICATIVA (all'interfaccia bande G-R, in corrispondenza di siti fragili, punti di rottura nei tumori, minisatelliti) • UN AUMENTO SIGNIFICATIVO DELLA FREQUENZA DI SCE E' INDICE DI INSTABILITA' GENETICA • TEST DEGLI SCE USATO IN MUTAGENESI • ALTA FREQUENZA DI SCE IN SINDROMI DA INSTABILITA' CROMOSOMICA (SINDROME DI BLOOM)

17. SCE L’esperimento e analogo a quello di Meselson e Stall: si dimostra che la replicazione del DNA è semicomservativa.

20. POTERE DI RISOLUZIONE • CAPACITA’ DI DISTINGUERE OGGETTI VICINI COME ENTITA’SEPARATE • ATTENZIONE!!! NON SI PARLA DI INGRANDIRE SINGOLI OGGETTI, MA DI DISTINGUERE OGGETTI SEPARATI • POTERE DI RISOLUZIONE DELL’OCCHIO UMANO = 0,1mm • POTERE DI RISOLUZIONE DEL MICROSCOPIO OTTICO = 0,2m • POTERE DI RISOLUZIONE DEL MICROSCOPIO ELETTRONICO = 0,0004m (4Å)

21. BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONEYUNIS, 1976 DUTRILLAUX, 1976 • L'UNITA' DI MISURA CITOGENETICA E' LA BANDA • LA RISOLUZIONE PUO' ESSERE AUMENTATA DIMINUENDO LA DIMENSIONE DELL’UNITA' DI MISURA • IL MICROSCOPIO ELETTRONICO NON AUMENTA LA RISOLUZIONE CITOGENTICA SI VEDONO PIU’ GRANDI LE BANDE, MA NON SI VEDONO PIU’ BANDE • SI PENSA DI PERCORRERE A RITROSO IL PROCESSO DI CONDENSAZIONE CROMOSOMICA • LA BANDA DEL CROMOSOMA METAFASICO SI SUDDIVIDE IN SOTTOBANDE NEL CROMOSOMA PROMETAFASICO E PROFASICO • DALLA BANDA METAFASICA DI 107-108bp SI PASSA ALLA BANDA PROFASICA DI CIRCA 106bp • IL NUMERO DI BANDE METAFASICHE PER GENOMA UMANO APLOIDE E' PARI A 400 • IL NUMERO MASSIMO DI BANDE PROFASICHE PER GENOMA UMANO APLOIDE E' PARI A 3000

22. DISPORRE DI UN NUMERO UTILE DI CELLULE METAFASICHE E’ FACILE. DAI PRIMI DEL ‘900 SI CONOSCE L’EFFETTO DELLA COLCHICINA: NON SI FORMA IL FUSO MITOTICO, LA DIVISIONE CELLULARE SI ARRESTA IN METAFASE. • COME SI PUO’ OPERARE PER OTTENERE UN NUMERO UTILE DI CELLULE PROMETAFASICHE O PROFASICHE? • SI SINCRONIZZANO LE CELLULE: • SI BLOCCA IL CICLO CELLULARE IN UN PUNTO PRECISO; • SI ATTENDE CHE TUTTE LE CELLULE ARRIVINO AL PUNTO DEL BLOCCO; • SI RIMUOVE IL BLOCCO IN MODO CHE TUTTE LE CELLULE DI UNA COLTURA RIENTRINO NEL CICLO A PARTIRE DALLA STESSO PUNTO; • SI ALLESTISCE IL PREPARATO CROMOSOMICO DOPO UN TEMPO SUFFICIENTE AFFINCHE’ LE CELLULE SI TROVINO IN PROMETAFASE O IN PROFASE.

23. SINCRONIZZAZIONE CELLULARE • STRESS: • TEMPERATURA (basse temperature) • COMPOSIZIONE DEL TERRENO (starvation, terreno senza siero) • INIBITORI DI FASI SPECIFICHE: • INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA (cloramfenicolo,…) • INIBITORI DELLA SINTESI DEL DNA N.B.B. L'ARRESTO DELLA CRESCITA DEVE ESSERE VELOCEMENTE REVERSIBILE: BLOCCO RILASCIO

24. I SISTEMI DI SINCRONIZZAZIONE PIU' UTILIZZATI IN CITOGENETICABLOCCANO LA FASE S BLOCCORILASCIO METOTREXATE (MTX) TIMIDINA BrdU TIMIDINA 2-DESOSSICITIDINA BrdU 2-DESOSSICITIDINA FudR TIMIDINA BrdU IL PIU’ DIFFUSO E IL PIU’ SEMPLICE E’: BLOCCO MTX RILASCIO BrdU O TIMIDINA

25. BLOCCO: MTX RILASCIO: BrdU O TIMIDINA G2 3h MTX 17h 5.5 h PROFASE 6 h PROMETAFASE 7 h METAFASE BrdU (Timidina) 5.5 h 6 h 7 h S 9h G1 10.5 h 24 h

26. MECCANISMO DI AZIONE MTX DIIDRODROFOLATO DHFR DIIDROFOLAOREDUTTASI MTX TETRAIDROFOLATO ACIDO N5, N10 METILEN- TETRAIROFOLICO -CH3 dUMP dTMP • IN PRESENZA DI MTX SI BLOCCA LA VIA ENDOGENA DI SINTESI DEI NUCLEOTIDI, DEVE ESSERE SFRUTTATA LA VIA DI SALVATAGGIO, SI CREA UNA DIPENDENZA DAI PRECURSORI ESOGENI • GLI ENZIMI TK E HGPRT DIVENTANO ESSENZIALI PER LA CRESCITA

27. BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONEAPPLICAZIONI • CITOGENETICA CLINICA • IDENTIFICAZIONE DI RIARRANGIAMENTI BILANCIATI • DEFINIZIONE DEI PUNTI DI ROTTURA DI RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI • CARATTERIZZAZIONE DI RIARRANGIAMENTI COMPLESSI • STUDIO DI SINDROMI DA GENI CONTIGUI, DISORDINI GENOMICI X-FRAGILE X q 27-28 DOUCHENNE (DMD) X p 21 PRADER WILLI 15 q 21 ANGELMAN 15 q 21

28. CITOGENETICA ONCOLOGICA • IDENTIFICAZIONE DI RIARRANGIAMENTI CAUSALI IN LEUCEMIE, LINFOMI, TUMORI SOLIDI • STUDIO DI MICRODELEZIONI ASSOCIATE A TUMORI (GENI ONCOSOPPRESSORI) CGL (leucemia granulocitica cronica) t(9;22) c-abl LINFOMA DI BURKITT t(8;14) c-myc RETINOBLASTOMA del 13 q 14 TUMORE DI WILMS del 11 p 13

29. CITOGENETICA COMPARATA • RICOSTRUZIONE DELL'EVOLUZIONE DEI CARIOTIPI • LOCALIZZAZIONE GENICA COMPARATA • STUDIO DELL’EVOLUZIONE DEI CROMOSOMI DEL SESSO • LOCALIZZAZIONE GENICA • BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONE ACCOPPIATO AD IBRIDI SOMATICI • BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONE ACCOPPIATO AD IBRIDAZIONE IN SITU.

30. COLORAZIONE STANDARD GIEMSA

31. BANDEGGIO QFQ

32. BANDEGGIO QFQ

33. BANDEGGIO GTG

34. BANDEGGIO GTG

35. BANDEGGIO GTG

36. BANDEGGIO GHG

37. BANDEGGIO GBG

38. BANDEGGIO RBA

39. BANDEGGIO RBA

40. BANDEGGI RBA E QFQ

41. BANDEGGIO CBG

42. G R G R G R G R G R G R

43. BANDEGGI GTG E RBG BANDEGGIO CBG

44. I CROMOSOMI 1, 2, 3 E 4 A DIVERSI LIVELLI DI RISOLUZIONE