RETOS ACTUALES EN INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR:

1. Red de Enfermedades Cardiovasculares Financia Ministerio de Salud, España RETOS ACTUALES EN INVESTIGACIÓN CARDIOVASCULAR: Aspectos Metodológicos, Moleculares, Clínicos y Terapéuticos Coordinadores: Dr. Vicente Andres G arcía Dr. Juan J. Calvete Ch. Dra. Marta Casado P. Resumen de algunos aspectos de las conferencias Iván Palomo Valencia, Mayo 2004

2. Rectorado Universidad de Valencia Sede del curso de RECAVA

3. Dr. Jordi Soler-Soler Coordinador RECAVA Necesidad de abordar la investigación cardiovascular de un modo multidisciplinar IAM 68.000 IAM/año (>Ca pulmón+colon+recto+mama) 34-40% de IAM llegan muertos al hospital 20% de IAM que llegan vivos al hospital mueren antes de 1 año. Factores de riesgo HTA 35% Tabaquismo 31% Hipercolesterolemia 21% Obesidad 19% Diabetes 11%

4. Impacto del tratamiento Mortalidad Extrahospitalaria: Intrahospitalaria : 50% de los pacientes con IAM no presentan FR CV clásicos De los FR CV clásicos Más importantes: HTA e HiperCol Diferente mortalidad según territorios y razas Investigación CV Multidisciplinar: Clínico, Epidemiólogo, Básico Esfuerzo necesario

5. Dr. Domingo Barettino IBV, CSIC Técnicas de genómica para la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas Genotipo Fenotipo Transcriptoma (RNA) Proteoma Interactoma* Genoma (DNA) * Interacción entre proteínas

6. Post-genómica • Se conocen varios genomas completos • Single Nucleotide Polymosphysm • Genómica funcional: • Investiga para que sirven los genes en diferentes tejidos • Uso de Microarrays (Northern blot x n) • Soportes • Sondas • Preparación RNA…cDNA ….Marcaje • Adquisición datos y cuantificación • Interpretación • (Genómica funcional: sobre-expresión de genes)

7. Dr. Juan Calvete IBV, CSIC Técnicas de proteómica para la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas • Genoma: múltiples proteomas (en diferentes tejidos) • Comparan células en estudio vs células controles: • - Electrof. bidimensional de proteínas:(1º por carga, 2º por tamaño) • Análisis de 1 “mancha” a la vez (diferente entre cels. estudio y control) • Proteína candidata a estudiar • Digestión con tripsina ….software. • Caracterización de péptidos (Secuencia aa): • Espectrómetro de masas • Pesquisa modificaciones post-traduccionales (glicosilaciones, fosforilaciones) • - Electrof. unidimensional • Si se analiza situaciones más simples

8. Dra Marta Casado IBV, CSIC Gen Proteína Modelo animal (Genómica) (Proteómica) Diseño de vectores para modificación genética y generación de animales transgénicos • Modelos celulares • Modelos animales • Transferencias directa de gen en animal adulto(transciente) • Animales transgénicos • Transgénesis clásica o aditiva • Microinyección • Rendimiento 1% • Transgénesis sustractiva • Knockout mouse • Rendimiento <1%

9. Dra. Lina Badimón Centro de Investigación Cardiovascular U. Autónoma de Barcelona; Hosp. Santa Creu i Sant Pau, Barcelona (>150 ISI) Bases moleculares de la cardiopatía isquémica y experimental e identificación de marcadores diagnósticos y nuevas dianas terapéuticas Aterotrombosis • Trombosis • Adhesión y agregación plaquetaria, c/s participación del Sist. Coagulación • Vilahur G, Duran X, Juan-Babot O, Casani L, Badimon L. Antithrombotic effects of saratin on human atherosclerotic plaques. Thromb Haemost. 2004 Jul;92(1):191-200. • Pedreno J, Hurt-Camejo E, Wiklund O, Badimon L, Masana L. Platelet function in patients with familial hypertriglyceridemia: evidence that platelet reactivity is modulated by apolipoprotein E content of very-low-density lipoprotein particles.Metabolism. 2000;49(7):942-9.

10. Dra. Badimón (cont.) • Genes en el endotelio son regulados por elementos de la sangre • PYP51 y ERG25: Participan en el metabolismo del colesterol. • Rodriguez C, Raposo B, Martinez-Gonzalez J, Llorente-Cortes V, Vilahur G, Badimon L. Modulation of ERG25 expression by LDL in vascular cells. Cardiovasc Res. 2003;58(1):178-85. • NOR-1: Factor de transcripción • Se expresa paredes vasculares con placa ateromatosa. • LDL regula la expresión de NOR-1. • Rius J, Martinez-Gonzalez J, Crespo J, Badimon L. Involvement of neuron-derived orphan receptor-1 (NOR-1) • in LDL-induced mitogenic stimulus in vascular smooth muscle cells: role of CREB. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(4):697-702. • Lisil Oxidasa (LOx): En la maduración del endotelio (fase inicial de la placa) • Rodriguez C, Raposo B, Martinez-Gonzalez J, Casani L, Badimon L. Low density lipoproteins downregulate lysyl oxidase in vascular endothelial cells and the arterial wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002;22(9):1409-14.

11. Dra. Bamidón (cont.) Otras líneas de investigación • Casani L, Segales E, Vilahur G, Bayes De Luna A, Badimon L.Moderate Daily Intake of Red Wine Inhibits Mural Thrombosis a nd Monocyte Tissue Factor Expression in an Experimental Porcine Model. Circulation. 2004 • Vilahur G, Segales E, Casani L, Badimon L. A novel anti-ischemic nitric oxide donor inhibits thrombosis • without modifying haemodynamic parameters. Thromb Haemost. 2004 May;91(5):1035- 43. • Royo T, Martinez-Gonzalez J, Vilahur G, Badimon L.Differential intracellular trafficking of • von Willebrand factor (vWF) and vWF propeptide in porcine endothelial cells lacking Weibel-Palade bodies • and in human endothelial cells. Atherosclerosis. 2003 Mar;167(1):55-63. • Factores de riesgo emergentes • PCR • CD40L (plaquetas activadas, células endoteliales activadas) • PAI-1 Investigación en animales Citometría de flujo Microscopía confocal Proteómica PCR real time Transgénicos (pendiente)

12. Dr. Josep Redón Hosp. Clínico de valencia Hipertensión arterial y Patología • HTA: Mayor causa de morbimortalidad de todos los países (D y SD) • Mas que Tabaquismo e Hipercolesterolemia. • Impacto sobre varios órganos diana: • Vasos sanguíneos (Moléculas de adhesión solubles: VCAM-1, E-selectina) • Cerebro • Corazón • Riñones • Fisiopatología de la HTA

13. Dr. Federico Mayor Centro de Biología Molecular; U. Autónoma de Madrid Alteraciones en la señalización y regulación de receptores acoplados a proteínas G en las ECV >1000 Receptores acoplados a Proteína G () • Arrestinas y GRK: • Bloquean la interacción de receptor-ligando con proteína G. • Gatillarían otros procesos • Reclutamiento de proteínas citoplasmáticas: • Clatrina • AP-2 • Otras Mayor F Jr, Penela P, Ruiz-Gomez A. Role of G Protein-Coupled Receptor Kinase 2 and Arrestins in beta-Adrenergic Receptor Internalization. Trends Cardiovasc Med. 1998;8(5):234-40.

14. Dr. Jaume Marrugat Institut Municipal d’Investigació Mèdica, Barcelona Epidemiología CV: del DNA al acontecimiento coronario Disminución de infecciones y aumento ECV • Aterotrombosis: Mayor causa de muerte en el mundo. • Manifestaciones clínicas mayores: • Accidente cerebrovascular • IAM (H:M=3:1) • TVP (vasculopatía periférica) • Mortalidad por cardiopatía isquémica: • Mayor en noreste de Europa, respecto a países del mediterráneo. • Mayor variabilidad inter-países que intra-países.

15. Mortalidad Incidencia Prevalencia Dr. Marrugat (cont.) • En España • Durante los últimos 20 añosincidencia de ECV estable: • H: 184/100.000 habitantes • M: 30/100.000 habitantes Por prevención secundaria y tto terciario. (No existiría prevención primaria) Tabaquismo Aumento del número de pacientes que requieren servicios de salud. No cura. En 20 años altas se han multiplicado

16. Dr. Marrugat (cont.) • Tipos de Placas ateromatosas • Clasificación histológica (6 tipos) • 1-4 : relativamente estables • 5, 6: Inestables • Muertos por IAM (España): Solo placas 1-4 • ¿Placas evolucionan más lentamente? • ¿Son más estables? • Adaptación de las tablas de Framingham a población española • (Estimación de riesgo coronario a 10 años) • Sexo • Colesterolemia, HDL-Col • Tabaquismo • Diabetes • www.regicor.org(tablas y publicaciones)

17. Dra. María Yañez Hospital de la Princesa, U. Autónoma de Madrid VLA -4 LFA-1 Región de unión a metales divalentes α1 β1 Extracelular β2 α4 VCAM-1 Región rica en C y S ICAM-1 Dominio Ig Membrana plasmática Intracelular Extracelular Puentes di-sulfuro Familia Integrinas Membrana plasmática Intracelular P Región de unión a carbohidratos E L Dominio tipo EGF SCR Extracelular Memb plasmática Intracelular Bases moleculares y celulares de la adhesión y migración transendotelial de leucocitos en patologías inflamatorias crónicas Moléculas de adhesión celular (MAC) Superfamilia Inmunoglobulinas Familia Selectinas

18. Contacto al azar Rodar Adhesión firme Diapedesis Adhesión tisular En Leucocitos participan las siguientes moléculas a) L-Selectina a) α4 β1 a) α4 β1 a) α3 β1 b) LFA-1 b) SLex. otros b) LFA-1 b) α4 β1 carbohidratos c) CD-31 a) α5 β5 Sialilados y fucosusilados Α4 β7 (mucosas) Células endoteliales Lumen Vascular Flujo Sanguíneo Leucocitos Tejidos Quimiotractantes a) GlyCAM-1 CD-34 Mad CAM-1 (mucosas) • VCAM-1 • ICAM-1, ICAM-2 • CD-31 • Mad CAM-1 (mucosas) En Cél. Endoteliales participan las siguientes moléculas • Epiligrina • Fn (CS-1) • Fn (RGD) • VCAM-1 • ICAM-1 b) E-Selectina P-Selectina Inductores: IL-2, IL-8, TNFα, MIP 1β Dra Yañez (cont.) Modelo de las interacciones adhesivas que actúan en la migración transendotelial

19. Dra Yañez (cont.) Proteínas ERM(Ezrin, Radixin, Moesin; citoplasmáticas) ICAM-1 ERM Actina • Tetraspaninas • CD9 • CD81 • CD151 Adhesión Movilidad Coestimulación Asociación a otras proteínas de membrana (ICAM-1, VCAM-1) MAC: proteínas muy ubicuas (malas dianas) Imágenes de rolling y migración transendotelial Citometría de flujo Microscopía confocal

20. Dr. Miguel Pocovi Inst. Aragonés de Ciencias de la Salud, Saragoza Desarrollo de biochips para el diagnóstico genético de la hipercolesterolemia familiar • Genes + ambiente = Hipercolesterolemia • En Hipercolesterolemias monogénicas … Principalmente genes: • LDL-R (>850 mutaciones) • ApoB-100 • ARH (estabilizadora de LDL-R) • AYP7A1 • Apo E • Molecular characterization of familial hypercholesterolemia in Spain: identification of • 39 novel and 77 recurrentmutations in LDLR. Mozas P, Castillo S, Tejedor D, Reyes G, • Alonso R, Franco M, Saenz P, Fuentes F, Almagro F, Mata P, Pocovi M. Hum Mutat. 2004;24(2):187. • Pocovi M, Civeira F, Alonso R, Mata P. Familial hypercholesterolemia in Spain: case-finding • program, clinical and genetic aspects. Semin Vasc Med. 2004; 4(1):67-74. • Garcia-Alvarez I, Castillo S, Mozas P, Tejedor D, Reyes G, Artieda M, Cenarro A, Alonso R, • Mata P, Pocovi M, Civeira F. Differences in clinical presentation between subjects with a phenotype • of familial hypercholesterolemia determined by defects in the LDL-receptor and defects in • Apo B-100. Rev Esp Cardiol. 2003;56(8):769-74.

21. Dr. Miguel Pocovi Biochip (microarray) para Hipercolesterolemia familiar LDL-R (>850 mutaciones) (Biotina) Denaturaión * Sondas específicas (25 nucleótidos) (con diferentes mutaciones) Estreptavidina Fluorocromo * Progénica

22. Dr. Santiago Lamas Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares,, Madrid Interacción entre Óxido nítrico (NO) y Metaloproteínasas en el Endotelio vascular • Metaloproteinasas de matriz (MMP) • Familia de enzimas • Acción en remodelación y reparación de tejidos. • Capacidad de degradar proteínas de sostén • Colagenasa-3 (MMP-13) • Interés en proceso inflamatorio de la aterosclerosis • El NOpuede modular la expresión de MMP • Induce acúmulo de MMP-13 en el frente de re-endotelización • NO y MMP-13: primera etapa de la revascularización • Knockout mouse en eNOS • Microscopía confocal

23. Dr. David García-Dorado Laboratorio de Cardiología Experimental Hospital Universitari Vall d`Hebrón Muerte celular durante la isquemia-reperfusión miocárdica y desarrollo de tratamientos preventivos Necrosis • Características • Depende de severidad y duración de isquemia. • En bandas de contracción. • Durante primeros minutos de reperfusión. • No se amplifica por apoptosis tardía (horas siguientes). • Se puede prevenir en primeros minutos de reperfusión. • Mecanismos • Detención de la fosforilación oxidativa. • Aumento de glicólisis anaerobia. • Acumulación de metabolitos. • Acidificación. • Aumento de Na+ • Ingreso de Ca2+

24. Dr. David García-Dorado Miocitos en situación de “rigor isquémico” se contraen. 99 ISI Agullo L, Garcia-Dorado D, Escalona N, Ruiz-Meana M, Inserte J, Soler-Soler J. Effect of ischemia on soluble and particulate guanylyl cyclase-mediated cGMP synthesis in cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;284(6):H2170-6. • Ruiz-Meana M, Pina P, Garcia-Dorado D, Rodriguez-Sinovas A, Barba I, Miro E, Mirabet M, Soler-Soler J.GLYCINE PROTECTS CARDIOMYOCYTES AGAINST LETHAL REOXYGENATION INJURY BY • INHIBITING MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION. J Physiol. 2004 Jun 24

25. Dr. Vicente Andres Laboratorio de Biología Vascular Inst. de Biomedicina de Valencia (IBV) Modelos experimentales de Aterosclerosis y Reestenosis: Aspectos moleculares y terapéuticos Aterosclerosis: Proceso inflamatorio Proliferación y migración celular

26. Dr. Vicente Andres 60 ISI • Andres V. Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling: new perspectives and therapeutic potential. Cardiovasc Res. 2004 Jul 1;63(1):11-21. • Proteína Kinasa, ciclina dependiente (CDK) • Proteínas inhibidoras de CDK (CDKIs) • Migración celular ocurre preferentemente en fases G1/S. • CDK y CDKIs regulan el ciclo celular • Diez-Juan A, Andres V. The growth suppressor p27(Kip1) protects against diet-induced • atherosclerosis. FASEB J. 2001;15(11):1989-95. • p27 regula aterogénesis • Polimorfismo (NTPs) de p27: C838A • AA … Menos p27….IAM ¿Estas proteínas como dianas farmacológicas? Ej. Fármaco que aumente síntesis de p27 Modelo animal: knockout mouse para apoE Estudios de microarrays: varios componentes del S. Complemento se inducen en respuesta a hipercolesterolemia en ratones deficientes en apoE

27. Dr. Francisco Fernandez Instituto de Ciencias del Corazón Terapia celular para el tratamiento de la cardiopatía isquémica • La reperfusión precoz fracasa en el 50%. • Miocitos no se regeneran. • Estrategias celulares: • Mioblastos de músculo estriado: No se integran bien en corazón. • Stem cells de MO vía sanguínea colonizan corazón: Beneficio dudoso • Stem cells localmente ….

28. Stem cells localmente, después de revascularización con stent 3/13 casos: reestenosis Mejor que solo con revascularización • Falta: • Estudios ramdomizados • Investigación experimental *

29. * * Dr. Jordi Soler Fotografía post-clausura del curso (60-70% de los asistentes al curso)

30. Dr. Vicente A. García Dr. Juan J. Calvete Dra. Marta Casado Dr. Domingo Barettino Café después de almuerzo. Frente al IBV