Régulations post-transcriptionnelles de l'expression génétique au cours du développement

1. Régulations post-transcriptionnelles de l'expression génétique au cours du développement Luc Paillard CNRS UMR 6061 Faculté de médecine Université Rennes 1 http://perso.univ-rennes1.fr/luc.paillard/ensgnmt/odonto080307.ppt

2. Introduction Place des régulations post-transcriptionnelles Fonctions cellulaires Activité "spécifique" (phosphorylations…) Dégradation Activité des protéines Concentrations Traduction Transcription Maturation Concentration d'ARNm Traductibilité Synthèse Dégradation des ARNm

3. Introduction Maturation des ARNm eucaryotes ADN Transcription ARN prémessager Ajout d’une queue poly(A) à l’extrémité 3’ 5' Ajout de coiffe (Cap) 7mG-PPP-N Excision des introns Epissage des exons Exon 1 Exon 2 Exon 3 5' Intron 1 Intron 2

4. Introduction Structure des ARNm eucaryotes Après l’épissage des exons! Région 5' non codante (5'UTR) Région 3' non codante (3'UTR) Queue poly(A) Phase codante 5' 3' AAAA…AAA Coiffe (Cap) 7mG-PPP-N AUG STOP

5. 1. Epissages différentiels et développement 2. Traduction, stabilité et état d’adénylation 3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants

6. 1. Epissages différentiels et développement Exons alternatifs Situation 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 3’ Exon 4 5' Situation 2

7. 1. Epissages différentiels et développement Exons alternatifs Situation 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 3’ Exon 4 5' Situation 2 Saut d’exon Situation 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 5' Situation 2 Et beaucoup d’autres possibilités…

8. 1. Epissages différentiels et développement L’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile Gène sex-lethal : transcription sous le contrôle de facteurs de transcription activiteurs et inhibiteurs Activateurs produits par le chromosome X Inhibiteurs produits par des autosomes Femelles XX : activateurs>inhibiteurs Synthèse sxl Male XY activateurs<inhibiteurs Pas de synthèse sxl (Pas de compensation de dosage…)

9. Femelle : sxl Male : pas de sxl sxl STOP STOP Protéine tra active Protéine tra tronquée : inactive 1. Epissages différentiels et développement L’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile La protéine sxl contrôle l’épissage alternatif de transformer

10. 1. Epissages différentiels et développement L’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile La protéine tra contrôle l’épissage alternatif de doublesex Male : tra inactif Femelle : tra actif tra Protéine dsx a un exon en plus chez la femelle que chez le male Même activité de liaison à l’ADN, mais effets différents sur la transcription

11. Fraction A- Northern blot Oligo(dT) cellulose ARN Fraction A+ Northern blot Monosomes (non traduit) Northern blot Centrifugation sur gradient de saccharose Polysomes (traduit) Northern blot 2. Traduction, stabilité et état d’adénylation L’exemple du développement précoce du xénope Extrait (œuf ou embryon)

12. 3. Hybridation avec une sonde radioactive complémentaire d'un ARN 1. Electrophorèse des ARN Gel d'agarose Sonde radiomarquée hybridée 4. Autoradiographie 2. Transfert sur membrane Le film photo est impressionné par la radioactivité Membrane de nylon Northern blot

13. Paris et Philippe (1990) Dev Biol 140, 221 Etat d'adénylation et traduction Corrélationétat A+ et traduction, état A- et absence de traduction

14. Répression traductionnelle Instable en général Stable chez le xénope jusqu ’à la MBT Stable Désadénylation 3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ AA..AA CADRE DE LECTURE CADRE DE LECTURE Polyadénylation Traduit Non traduit Stimulation traductionnelle Les variations de longueur de la queue poly(A) régulent l'expression génétique

15. Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (1) • Certains ARNm sont polyadénylés pendant la • maturation ovocytaire • Mais qu’est-ce que la maturation ovocytaire? • Méiose (PI à MII) • Pas de transcription • Peut être faite in vitro (progestérone)

16. Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (2) Alignement des séquences d'ARNm polyadénylés pendant la maturation ovocytaire McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803

17. Injection d'ARN synthétisés in vitro, radiomarqués, contenant ou non la séquence à tester Extraction des ARN après incubation (en présence ou non de Pg) Électrophorèse, autoradiographie t0 t1 t0 t1 A+ A+ ARN polyadénylé pendant l'incubation ARN non polyadénylé pendant l'incubation A0 A0 Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (3) Test de la séquence : principe

18. Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (4) Test de la séquence : Résultats Une séquence non spécifique (AAUAAA) et une séquence spécifique sont nécessaires à la polyadénylation cytoplasmique La séquence spécifique a été appelée CPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element) McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803

19. Régulation de la polyadénylation dépendante du CPE Identification de la CPEB (CPE Binding protein) Modèle : - Le CPE lie la CPEB - La CPEB provoque la polyadénylation des ARNm auxquels elle est liée Pourtant : - La CPEB est présente dès le début de l'ovogenèse...

20. A. Dans l'ovocyte non maturé CPEB CPE 5' 3' Pas de traduction B. Pendant la maturation ovocytaire CPEB Progesterone Eg2 protein P CPEB + Traduction CPE 5' AAA…AAA 3' Régulation de l'activité de la CPEB

21. Fonction de la polyadénylation contrôlée par la CPEB L’injection d’anticorps anti CPEB bloque la maturation ovocytaire Identification de certains ARNm dont la polyadénylation est nécessaire à la maturation (c-mos…)

22. Mais ce n’est pas tout! Souris dont le gène CPEB est inactivé… Fonction dans le fonctionnement neuronal

23. Et les désadénylations?

24. Contrôles aberrants de l’état d’adénylation des ARNm et pathologies humaines Exemple 1 L'ARNm a-globine est très stable pendant la différenciation érythrocytaire Cette stabilité lui est conférée par un élément de séquence dans la 3'UTR Cet élément maintient une queue poly(A) longue sur l'ARNm a-globine Une forme de thalassémie est liée à l'inactivation de cet élément

25. Contrôles aberrants de l’état d’adénylation des ARNm et pathologies humaines Exemple 2 Les ARNm des cytokines ou proto-oncogènes sont souvent très instables Cette instabilité leur est conférée par un élément de désadénylation dans la 3'UTR L'inactivation de cet élément conduit à la surexpression de la protéine codée Cette surexpression peut être associée à une transformation cellulaire

26. 3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Et alors? RNAi Prix Nobel oct 2006 (C Mello, A Fire) miRNA siRNA Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

27. 3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Mécanismes biochimiques Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

28. Biosynthèse des miRNA Reconnaissance d’un ARN double brin par Argonaute! Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

29. Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt : Conséquence : inhibition de la traduction de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez l’animal Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

30. Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

31. Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante… … Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitement complémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque sa dégradation… voie « siRNA » chez l’animal

32. Reprenons… miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome de la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé) Environ 250 chez l’humain S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe sa traduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…) En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNm siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateur dans une cellule animale S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation

33. Utilisation des siRNA L’expression d’un ARN double brin (2*22nt) dans une cellule animale provoque la dégradation des ARNm dont la séquence est parfaitement identique à celle de l’un des deux brins Applications en recherche… … Et en médecine?

34. Régulations post-transcriptionnelles par les miRNA et développement L’exemple de Caenorhabditis elegans

35. * La vulve de Caenorhabditis elegans proximité de la vulve.

36. * Formation de la vulve proximité de la vulve. P6.p se divise en cellules qui se différencieront en cellules centrales de la vulve P5.p et P7.p se divisent en cellules qui se différencieront en cellules latérales de la vulve Rôle de AC (induction)

37. Les inductions dans la formation de la vulve Première induction (voie EGF) Deuxième induction (voie Notch) « Marqueurs » de destinée cellulaire Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

38. La GFP “marque” les cellules P5.p et P7.p, mais pas P6.p Contrôle Le miRNA mir-61 est présent dans P5.p et P7.p, mais pas P6.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

39. … Sauf si on exprime le miRNA mir-61 dans P6.p Contrôle Expression de mir-61 dans P6.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

40. … Sauf si on fait s’exprimer le miRNA mir-61 dans P6.p Contrôle Expression de mir-61 dans P6.p mir-61 exprimé dans P6.p « fait devenir » P6.p comme P5.p et P7.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

41. Recherche d’un ARNm cible de mir-61 Fonction de la protéine codée par cet ARNm : faire « devenir une cellule comme P6.p » Dans l’embryon normal : mir-61 est présent dans P5.p et P7.p Il empêche l’expression de cet ARN dans P5.p et P7.p P5.p et P7.p deviennent « comme P5.p et P7.p » Si on exprime mir-61 dans P6.p Il empêche l’expression de cet ARNm dans P6.p aussi P6.p devient « comme P5.p et P7.p » ARNm codant la protéine vav-1 Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

42. D’où la fonction d’un miRNA dans la mise en place de la vulve… … Implication dans d’autres processus de développement chez C. elegans

43. Le cycle de C. elegans

44. Les mutants hétérochrones chez C. elegans Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653

45. Rôle de miRNA dans la coordination d’évènements de développement chez C. elegans Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653

46. miRNA et pathologies humaines (1) Mutation dans la 3’UTR de SLITRK1, au niveau du site de reconnaissance de miR-189 Perte de la répression traductionnelle de SLITRK1 : surexpression de la protéine SLITRK1 Responsable de la maladie?

47. miRNA et pathologies humaines (2)

48. miRNA et pathologies humaines (3)