Le applicazioni attuali delle biotecnologie NON OGM nel settore alimentare

1. Le applicazioni attuali delle biotecnologie NON OGM nel settore alimentare diego.mora@unimi.it www.distam.unimi.it

2. I MICRORGANISMI E GLI ALIMENTI

3. Streptococcus thermophilus Lactobacillus delbruecki bulgaricus Bifidobacterium bifidum Penicillium roqueforti Saccharomyces cerevisiae Quanti microrganismi ingeriamo con gli alimenti? Si ingeriscono anche vivi?

4. L’identità tassonomica, cioè il numero delle specie, e il grado di diversità biologica dei ceppi che colonizzano l’alimento in ogni stadio del processo produttivo, dalla materia prima al prodotto finito; • distribuzione spaziale delle specie microbiche nel prodotto; • effetto dei fattori intrinseci e di processo-conservazione che possono influenzare la crescita, la sopravvivenza e le attività metaboliche microbiche; • dati quantitativi che descrivono l’andamento delle popolazioni di specie e ceppi microbici durante le diversi fasi del processo produttivo; La valutazione del grado di diversità biologica rimane sempre una stima della reale diversità microbica esistente sia per la difficoltà di recuperare le specie presenti a bassa concentrazione nel campione, sia per l’annoso problema delle specie non coltivabili. La MICROBIOLOGIA ALIMENTARE può essere considerata una branca dell’ECOLOGIA MICROBICA Al fine di gestire al meglio le condizioni di crescita e le attività metaboliche dei microrganismi per l’ottenimento di alimenti sono necessarie una serie di informazioni inerenti a:

5. L’ identità tassonomica e il grado di diversità biologica … Variabilità fenotipica tra ceppi che appartengono alla stessa specie Identificazione a livello di genere e specie, secondo un approccio POLIFASICO ovvero di un approccio basato su valutazioni fenotipiche e genotipiche. CARATTERIZZAZIONE GENETICA E FENOTIPICA DI MICRORGANISMI DI INTERESSE ALIMENTARE L’ identificazione appropriata di una specie batterica avviene essenzialmente attraverso analisi molecolari … ma non è mai una pratica semplice e scontata ! GENOTIPO (per identificare la specie) Analisi filogenetica basata sulla sequenza del gene 16S rRNA del ceppo isolato. … perché la definizione di specie batterica non ha “contorni definiti” ... perché non è così raro individuare ceppi batterici che appartengono a specie o generi non ancora descritti

6. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) ITS (Internal Transcribed ribosomal Spacer analysi) Potere di risoluzione RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA fingerprinting analysis) Rep-PCR (Repetitive Elements PCR) PCR-based fingerprinting methods (AFLP) Come procedere quando devo identificare un numero elevato di ceppi isolati da un determinato prodotto alimentare? GENOTIPO (per ottenere gruppi omogenei di ceppi appartenenti alla stessa specie) Tecniche molecolari basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) e quindi su informazioni presenti a livello del genoma batterico.

7. Ceppi Isolati in coltura pura 16S rRNA Specie D e E Specie A Specie B e C Specie B Specie C Specie A ITS (16S-23S rRNA) Specie D e E Potere di risoluzione RAPD, rep-PCR, etc. Specie D Specie E Specie B Specie C Specie A Specie A

8. Mette in evidenza una VARIABILITA’ GENOTIPICA NON NECESSARIAMENTE CORRISPONDENTE ALLA VARIABILITA’ FISIOLOGICA e alle caratteristiche TECNOLOGICHE del ceppo Indispensabile una caratterizzazione FENOTIPICA Metabolismo Energetico Primario (Respirazione e/o Fermentazione). Questa informazione si può considerare acquisita contemporaneamente all’identificazione molecolare a livello di specie. Potere di risoluzione Caratterizzazione delle attività metaboliche di interesse tecnologico. Spesso si tratta di caratteristiche dei singoli ceppi piuttosto che della “specie”. La CARATTERIZZAZIONE GENOTIPICA ottenuta a livello di CEPPO

9. Metabolismo del LATTOSIO/Galattosio Sistema PROTEOLITICO Caratterizzazione delle attività metaboliche di interesse tecnologico. Caratteristiche dei singoli ceppi piuttosto che della “specie”. L’AUTOLISI La produzione di AROMI La sintesi di ESOPOLISACCARDI La produzione di MOLECOLE ad ATTIVITA’ ANTIBATTERICA La RESISTENZA AI BATTERIOFAGI

10. Metabolismo del LATTOSIO/Galattosio In alcuni casi si preferisce selezionare ceppi incapaci di utilizzare il lattosio (L. delbrueckii per produzione di yogurt) ? Effetti diretti sulla velocità di acidificazione S. thermophilus non utilizza il galattosio derivato dall’idrolisi del lattosio e il suo accumulo nella matrice alimentare può facilitare lo sviluppo di microrganismi alterativi

11. Sistema PROTEOLITICO Effetti diretti sulla velocità di acidificazione Effetti indiretti sul processo di maturazione dei formaggi (endopeptidasi) Modulare lo sviluppo di sapori amari dovuti alla formazione di peptidi conteneti amminoacidi idrofobici (Leu, Phe e Pro) Può determinare la formazione di peptidi BIOATTIVI a partire dall’idrolisi delle proteine del latte (Inibitori dell’ACE e casomorfine)

12. L’AUTOLISI endopeptidasi Effetti diretti sul processo di maturazione dei formaggi. Inoculi con ceppi selezionati autolitici riducono i tempi del processo di maturazione.

13. La produzione di AROMI Effetti diretti sulle qualità organolettiche del prodotto finito. (Enzimi coinvolti nel catabolismo degli amminoacidi, glutammato-deidrogenasi, transaminasi, idrossimetil-transferasi) Diacetile, acetaldeide etc.

14. La sintesi di ESOPOLISACCARDI Effetti diretti sulla texture del prodotto fermentato (Yogurt). Consente di ridurre la % di sostanza grassa.

15. La produzione di MOLECOLE ad ATTIVITA’ ANTIBATTERICA ceppo batterico pro-tecnologico batteri patogeni e/o alterativi Si tratta di molecole di sintesi proteica (batteriocine), direttamente coinvolti nel processo di fermentazione, e in grado di contrastare lo sviluppo di microrganismi alterativi o patogeni. Rappresentano un valore aggiunto nelle caratteristiche di una coltura starter.

16. La RESISTENZA AI BATTERIOFAGI Importante sia in fase produttiva di biomasse da utilizzare come starter che in fase di caseificazione In alcuni casi l’induzione di un ciclo litico viene sfruttato per accelerare il processo di maturazione dei formaggi

17. L’adesione alle cellule epiteliali intestinali delle specie PROBIOTICHE … una delle condizioni “essenziali” per definire un ceppo probiotico

18. B. Bifidum NAB1. Lactobacillus sp. B. Bifidum NAB1. B. Bifidum NAB1 Adesione di Bifidobacterium bifidum NAB1 su cellule epiteliali intestinali coltivate in vitro (Caco-2 cell layer)

19. Un aiuto dal sequenziamento dei genomi microbici genomi di piccole dimensioni (1,8 – 3 Mbp) il background culturale (biologia molecolare, genetica, biotecnologie) consente una loro “facile” annotazione attribuire a ciascun gene una “funzione” nel metabolismo cellulare … posso prevedere cosa “sa fare” un microrganismo sulla base della sequenza del suo genoma …

20. Streptococcus thermophilus - genome

21. La variabilità genetica e la “biodiversità” esistenti nel mondo microbico consentono, nella maggior parte dei casi, di individuare il microrganismo (ceppo) più adatto ad un determinato processo produttivo … quando ciò non è possibile … la selezione di mutanti “naturali” rappresenta un ottimo strumento per ottenere il “nuovo” microrganismo con le caratteristiche desiderate … … in ogni caso la costruzione di microrganismi geneticamente modificati può aiutare (in laboratorio) a comprendere le funzioni di singoli geni o gruppi di geni nel metabolismo cellulare e il loro contributo “tecnologico” … … esistono tecnologie Food-Grade per ottenere microrganismi ricombinanti …ma non sono attualmente accettate dai consumatori perché …