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VALUTAZIONE DELLA PERMEABILITA’ INTESTINALE MEDIANTE TEST DEL DOPPIO ZUCCHERO VALUTATO SU SIERO CON METODICA HPLC. Dott.ssa Katouzian Forough 26 Novembre 2004. ATTIVITA’ SVOLTA.
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VALUTAZIONE DELLA PERMEABILITA’ INTESTINALE MEDIANTE TEST DEL DOPPIO ZUCCHERO VALUTATO SU SIERO CON METODICA HPLC Dott.ssa Katouzian Forough 26 Novembre 2004
ATTIVITA’ SVOLTA • Determinazione della minima dose efficace, sulla permeabilità epiteliale di nuovi modulatori della via paracellulare • Studio della cinetica d’azione sulla permeabilità intestinale, di molecole (es. delta-G, esapeptide) in grado di modulare la via paracellulare • Verificare la cinetica del transito di macromolecole attraverso la mucosa intestinale resa permeabile dalle molecole sopra descritte.
Introduzione • La permeabilità intestinale viene solitamente studiata usando il test di assorbimento di 2 zuccheri lattulosio/mannitolo o lattulosio/ramnosio. Le urine (raccolta di 5 ore) sono il liquido biologico su cui dosare gli zuccheri. • Sono zuccheri di origine sintetica, non sono presenti nella dieta e non sono metabolizzati dall’organismo. • Il lattulosio è un disaccaride di PM 342.3 viene assorbito per via paracellulare mentre il ramnosio è un monosaccaride di PM 182.17 e viene assorbito per via transcellulare
Epitelio intestinale in condizione normale è impermeabile al lattulosio per la sua dimensione mentre è permeabile al ramnosio • Assorbimento dei due zuccheri risulta alterato se intervengono infezioni batteriche o virali ed in particolari situazioni patologiche (malattia celiaca, morbo di crohn) • Il test si basa sulla somministrazione per via orale dei due zuccheri e sul successivo loro dosaggio sulle urine mediante HPLC
SCOPO DELLA RICERCA • Semplificare lo studio della permeabilità intestinale mediante test sierologico su goccia di sangue del rapporto lattulosio/ramnosio. • Valutare l’azione di sostanze capaci di modulare in maniera reversibile la permeabilità della via paracellulare con conseguente variazione nell’assorbimento dei due zuccheri. • Dosare questi zuccheri, dopo somministrazione per via orale, su micro campioni di siero (50µl) e confronto con la metodica basata sulla raccolta urine. • Per il dosaggio utilizzeremo sempre la metodica HPLC.
Caratteristiche strutturali della molecola delta-G utilizzata nel nostro modello sperimentale di permeabilità epiteliale
Determinazione della minima dose efficace di ΔG Preparazione della soluzione dei zuccheri con diverse concentrazioni di ΔG • 120mg lact + 40mg Rh + 250ng ΔG in 200µl H2O • 120mg lact + 40mg Rh + 500µg ΔG in 200µl H2O • 120mg lact + 40mg Rh + 1µg ΔG in 200µl H2O • 120mg lact + 40mg Rh + 5µg ΔG in 200µl H2O • 120mg lact + 40mg Rh + 10µg ΔG in 200µl H2O
Prova su topi • Prelievo di sangue (circa 100µl) a tempo 0 • Somministrazione della soluzione di zuccheri senza e con + ΔG • Prelievo successivo dopo 1h, • Sierare il campione di sangue • Deproteinizzare il siero • Marcare il siero con FMOC-Idrazina • Dosare gli zuccheri con HPLC
Confronto goccia di sangue con raccolta urine. • raccolta urine a tempo zero • somministrazione di soluzione degli zuccheri con Delta-G • raccolta a 5h delle urine (utilizzando gabbia metabolica) • filtrare il campione • analisi con HPLC
Condizioni per il dosaggio degli zuccheri con HPLC Eluenti : A) ACN 25% - H2O 75% B) ACN 80% - H2O 20% Colonna : C18, lungh.10cm, Ø3µm, Vol. camp : 5µl flusso : 1ml/min Temp : ambiente Rilevatore : spettrofotometro (λ 270 nm)
Concentrazione di lattulosio e ramnosio nel siero dopo somministrazione degli zuccheri senza Delta-G animali lattulosio ramnosio L/R topi 0.018 0.33 0.052 conigli siero 0.0033 0.137 0.026 conigli urine 0.0067 0.284 0.023
Concentrazione di lattulosio e ramnosio nel siero dopo somministrazione degli zuccheri con Delta-G animali lattulosio ramnosio L/R topi 0.19 0.36 0.53 conigli siero 0.033 0.157 0.22 conigli urine 0.074 0.296 0.25
STUDIO DELLA CINETICA • Prelievo di sangue a tempo zero • Somnistrazione della soluzione dei zuccheri contenente 10µg di ΔG • Prelievo successivo dopo 1h, 6h • Somnistrazione della soluzione dei zuccheri senza ΔG • Prelivo successivo dopo 7h, 9h, 11h
RISULTATI • Aumento della concentrazione di lattulosio in presenza di ΔG quindi: • Evidente attività biologica da parte di ΔG sulle giunzioni serrate • La sua attività biologica permane 6h dalla sua somministrazione per os
OBIETTIVI FUTURI • Continuare lo studio della cinetica per un tempo prolungato (almeno fino 24 ore) • Utilizzare queste molecole per permettere l’assorbimento di farmaci e peptidi attraverso la via paracellulare